酶法提取豬皮中膠原蛋白的工藝優(yōu)化

吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文題目名稱：酶法提取豬皮中膠原蛋白的工藝優(yōu)化學(xué)生姓名：王發(fā)明 院系：生命科學(xué)學(xué)院專業(yè)年級(jí):07級(jí)生物技術(shù)指導(dǎo)教師：三莘 職稱：教授2011年5月17日TOC\o"1-5"\h\z題目 I摘要及鍵詞 I1前言 12實(shí)驗(yàn)材料和方法 12.1實(shí)驗(yàn)材料和儀器 12.1.1實(shí)驗(yàn)材料及試劑 12.1.2實(shí)驗(yàn)儀器 12.2實(shí)驗(yàn)方法 12.2.1豬皮的簡(jiǎn)單預(yù)處理 12.2.2膠原蛋白的提取和純化 12.3蛋白質(zhì)含量測(cè)定 12.3.1考馬斯亮藍(lán)法 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 樣品蛋白的測(cè)定 蛋白質(zhì)含量計(jì)算 23結(jié)果與分析 2\o"CurrentDocument"3.1酶處理?xiàng)l件對(duì)膠原蛋白提取量的影響 2\o"CurrentDocument"3.1.1酶處理pH值對(duì)膠原蛋白提取量的影響 2\o"CurrentDocument"3.1.2酶處理時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取量的影響 3\o"CurrentDocument"3.1.3酶處理溫度對(duì)膠原蛋白提取量的影響 33.1.4加酶量對(duì)膠原蛋白提取量的影響 44討論 45結(jié)論 5參考文獻(xiàn) 5致謝 6酶法提取豬皮中膠原蛋白的工藝優(yōu)化姓 名：王發(fā)明專 業(yè)：生物技術(shù)指導(dǎo)教師：王莘摘要：目的：對(duì)豬皮中進(jìn)行膠原蛋白提取。方法：用中性蛋白酶預(yù)處理豬皮，再用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)得膠原蛋白的含量。結(jié)果：在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)確定膠原蛋白提取的最佳條件：酶處理pH6,加酶量(E/S)400U/g，溫度40°C,處理時(shí)間2h。關(guān)鍵詞：膠原蛋白；酶處理；考馬斯亮藍(lán)Semi-bionicextractionofpigskintooptimizethetechnologyof

collagenName:WangFamingMajor:BiotechnologyTutor:WangXinAbstract：purpose:Thepigskinextractionofcollagen.Methods:useneutralproteasepretreatmentpigskin,reoccupytestmeasuredMaSiLiangbluemethodofcollagencontent.Results:onthebasisofsinglefactorexperiment,throughthecontrastexperimentdeterminedthebestconditionofcollagenextractionenzymetreatmentpH6,add,enzymequantity(E/S)400U/g,temperature40°C,theprocessingtime2h.Keywords:Collagen;Enzymetreatment;CoomassieBrilliantBlue1前言豬皮中的蛋白質(zhì)含量高達(dá)33%,其中膠原蛋白含量為87.8%［1］，而瘦豬肉的蛋白含量?jī)H為18%左右。由此看來(lái)豬皮中的蛋白質(zhì)含量遠(yuǎn)高于瘦豬肉，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值十分可觀。此外膠原蛋白具有特殊的結(jié)構(gòu)與功能，并具有皮膚保濕等的用途，開發(fā)膠原蛋白產(chǎn)品已經(jīng)成為人們研究的熱點(diǎn)［樵隨著生物和高分子科學(xué)的不斷發(fā)展，人們會(huì)對(duì)此有更深的了解和認(rèn)識(shí)，因此開發(fā)膠原蛋白資源具有廣闊的前景。本論文實(shí)驗(yàn)研究主要利用中性蛋白酶處理豬皮，采用考馬斯亮藍(lán)方法測(cè)定豬皮中的膠原蛋白含量的方法。通過(guò)酶的不同處理?xiàng)l件，膠原蛋白提取量的比較來(lái)確定膠原蛋白提取的最佳條件，是對(duì)膠原蛋白的提取進(jìn)行的基礎(chǔ)性研究工作。2材料和方法2.1實(shí)驗(yàn)材料和儀器2.1.1實(shí)驗(yàn)材料及試劑豬皮，中性蛋白酶，牛血清蛋白，無(wú)水乙醇，NaCl溶液，蒸餾水，考馬斯亮藍(lán)溶液2.1.2實(shí)驗(yàn)儀器電動(dòng)攪拌器，電子天平，恒溫水浴鍋，離心機(jī)，分光光度計(jì)2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1豬皮的簡(jiǎn)單預(yù)處理⑶將皮下脂肪剔除，切成10mmx10mm的小塊，用35C的清水洗2次，再用無(wú)水乙醇浸泡，振蕩約10小時(shí)，棄掉有機(jī)溶劑。2.2.2膠原蛋白提取和純化稱取一定量經(jīng)簡(jiǎn)單預(yù)處理的皮塊于燒杯中，加入相應(yīng)量的中性蛋白酶，并用緩沖溶液控制pH值，在一定溫度下攪拌一定時(shí)間，離心去殘?jiān)?，上清液?jīng)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)得蛋白質(zhì)提取量⑸。2.3蛋白質(zhì)含量的測(cè)定2.3.1考馬斯亮藍(lán)法標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作⑹稱取10mg牛血清蛋白用蒸餾水定容至100ml（100ug/ml）分別取0ml,0.1ml,0.2ml,0.3ml,0.4ml,0.5ml,0.6ml,0.7ml,0.8ml，用蒸餾水補(bǔ)足1ml,再分別加入5ml考馬斯亮藍(lán)G-250,搖勻。放置2min后在595nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定（比色應(yīng)在1h內(nèi)完成測(cè)定）。以牛血清蛋白含量（ug）為縱坐標(biāo)，以吸光度為橫坐標(biāo)。如圖3-1圖2-1標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure2-1standardcurve樣品蛋白的測(cè)定取1試管準(zhǔn)確加入0.1ml蛋白溶液，再加入0.9ml蒸餾水，5ml考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，充分混合，放置2min后，以標(biāo)準(zhǔn)曲線1號(hào)試管做參比，在595nm波長(zhǎng)下比色，記錄吸光度蛋白質(zhì)含量計(jì)算樣品蛋白質(zhì)含量（ug/g）=CVT/WVS試中C——查標(biāo)準(zhǔn)曲線值VT——提取液總體積W——豬皮鮮重VS——測(cè)定時(shí)加樣量3結(jié)果與分析3.1酶處理?xiàng)l件對(duì)膠原蛋白提取量的影響3.1.1酶處理pH值對(duì)膠原蛋白提取量的影響稱取一定量經(jīng)簡(jiǎn)單預(yù)處理的豬皮,在不同pH體系下進(jìn)行酶處理，酶處理溫度35C、酶處理時(shí)間2h、加酶量400U/g。之后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)法測(cè)得蛋白質(zhì)含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3-1所示。Figure3-1EnzymestoextractproteinwhenprocessingtheamountofthepHinfluence從圖3-1可以看出，蛋白的提取量在pH6到6.5的區(qū)間內(nèi)不斷升高，pH6.5時(shí)達(dá)到最大值，而PH6.5到7.5之間逐漸下降，之后逐漸趨于平穩(wěn)，說(shuō)明pH6.5是該酶的最適PH。3.1.2酶處理時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取量的影響稱取一定量經(jīng)簡(jiǎn)單預(yù)處理的豬皮，用酶處理不同的時(shí)間，酶處理溫度35C、pH6.5加酶量400U/g。之后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)法測(cè)得蛋白質(zhì)含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3-2所示。圖3-2酶處理時(shí)間對(duì)蛋白量的影響Figure3-2Enzymestoproteinprocessingtimetheamountofinfluence從圖3-2可以看出，蛋白提取量在酶處理時(shí)間1小時(shí)到2小時(shí)逐漸升高，在2小時(shí)時(shí)達(dá)到最大值，之后又隨著酶處理時(shí)間增加而降低，說(shuō)明該酶的最適處理時(shí)間為2小時(shí)。3.1.3酶處理溫度對(duì)提取量的影響稱取一定量經(jīng)簡(jiǎn)單預(yù)處理的豬皮，在不同溫度下進(jìn)行酶處理，酶處理時(shí)間2h、pH6.5、加酶量400U/g。之后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)法測(cè)得蛋白質(zhì)含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3-3所示。處理溫度幻圖3-3酶處理溫度對(duì)蛋白量的影響Figure3-3Enzymetreatmenteffectoftemperatureonproteinquantity從圖3-3可以看出蛋白的提取量隨著酶處理溫度的升高而逐漸升高在40C的時(shí)候達(dá)到最大追，之后又隨著溫度升高而降低，說(shuō)明該酶的最適溫度為40C。3.1.4加酶量對(duì)膠原蛋白提取量的影響稱取一定量經(jīng)簡(jiǎn)單預(yù)處理的豬皮，采用不同的加酶量對(duì)豬皮進(jìn)行酶處理，酶處理溫度35C、pH6.5、時(shí)間2h。之后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)法測(cè)得蛋白質(zhì)含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3-4所示。加u/g)200400600加u/g)200400600800圖3-4加酶量對(duì)蛋白量的影響Figure3-4Addenzymeamountofproteinamountofinfluence從圖3-4可以看出，蛋白提取量隨著加酶量的增加而組建升高在400U/g時(shí)達(dá)到最大值，之后隨著加酶量增加而組建降低，說(shuō)明加酶量在400U/g時(shí)蛋白提取量最大。4討論4.1膠原蛋白的提取量在pH值6.5時(shí)最大。而在兩邊區(qū)域，蛋白量均有所降低。這說(shuō)明對(duì)于中性蛋白酶而言，在pH偏酸性時(shí)，對(duì)豬皮的處理效果最好。4.2膠原蛋白的提取量在酶處理時(shí)間為2h時(shí)出現(xiàn)最高值。而在兩邊區(qū)域，蛋白質(zhì)的量均有所降低，酶處理時(shí)間過(guò)短，不能充分疏松豬皮表層結(jié)構(gòu)、除去非纖維蛋白中的球狀蛋白、軟化膠原蛋白的皮層，酶處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，豬皮中部分膠原蛋白可能溶于緩沖溶液中，導(dǎo)致豬皮中膠原蛋白溶失，膠原蛋白提取量低，因此酶處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短，都會(huì)影響膠原蛋白的提取量。4.3膠原蛋白的提取量在酶處理溫度40°C時(shí)出現(xiàn)最高值。而在兩邊區(qū)域，提取率均有所降低。說(shuō)明中性蛋白酶在40C時(shí)酶處理效果最好，過(guò)高或者過(guò)低的溫度都可能導(dǎo)致酶活性的降低，甚至失活，從而影響酶處理的效果。4.4膠原蛋白的提取量在加酶量400U/g時(shí)出現(xiàn)最高值。而在兩邊區(qū)域，提取率均有所降低。這是由于中性蛋白酶作為一種生物催化劑，對(duì)底物的吸附作用有一定的飽和度，隨著加酶量的增加，與底物的結(jié)合是逐漸飽和，因此提取率逐漸增加；然而，當(dāng)酶用量增大到飽和值后，豬皮中一部分膠原蛋白由于受酶作用而被緩沖溶液溶解，所以導(dǎo)致提取率略有下降。5結(jié)論采用中性酶法預(yù)處理再用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定豬皮中膠原蛋白的最佳工藝條件是酶處理pH6.0、處理溫度40°C、加酶量(E/S)400U/g、處理時(shí)間2h。參考文獻(xiàn)李開雄，趙志遠(yuǎn)，劉霞.豬皮中膠原蛋白的提取及其應(yīng)用[J].肉類研究，1996(4):43481LeeChiH,SinglaAnuj,LeeYugyung.Biomedica.applicationsofCollagen[J].Inter2nationalJournalofPharmaceutics,2001,221:1-221齊玉堂.低脂膠原蛋白制取工藝的研究[J].肉類工業(yè)，2004(5):28301胡勝,李志強(qiáng)，陳敏.豬皮殘存As11398酶活力的酸性抑制[J].中國(guó)皮革，2001,30(21):13151蔣挺大,張春萍.膠原蛋白[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2001食品衛(wèi)生檢驗(yàn)法(理化部分)[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,1986杜敏，南慶賢.豬皮中膠原蛋白的制備及在食品中的應(yīng)用[J].食品科學(xué)，1994(7):37391張毅，向釗，朱丹等榮昌豬繁殖性狀的研究[J]，中國(guó)畜牧雜志2004,40(5):52一55張全生，肖國(guó)生.榮昌豬的歷史、現(xiàn)狀及發(fā)展對(duì)策陰，畜牧獸醫(yī)雜志，2005(5):72一73郭宗義，范首君.榮昌豬保種利用存在的問(wèn)題與對(duì)策[J],豬業(yè)科學(xué)2006,(6):78一80宋凡，曾代勤，王金勇.榮昌豬的保存和利用閉，