DNA片段的擴增-PCR技術(shù)

DNAPCR【教學(xué)目標(biāo)】〔一〕認(rèn)知目標(biāo)1、了解PCR技術(shù)的根本操作步驟。2、理解PCR的原理。3、爭論PCR技術(shù)在生產(chǎn)生活中的應(yīng)用。〔二〕力氣目標(biāo)1、通過多聚酶鏈?zhǔn)椒错憯U增DNA片段，熬煉學(xué)生實際動手力氣。2、通過嚴(yán)格把握溫度等反響條件，培育周密的思維力氣?！踩城楦?、態(tài)度與價值觀目標(biāo)1、通過對PCR試驗的操作及結(jié)果分析，培育學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度和實事求是的科研精神。2、通過對生物高技術(shù)的接觸，加深學(xué)生對試驗科學(xué)的寵愛?！菊n題重點】PCR的原理和PCR的根本操作?！菊n題難點】PCR的原理【教學(xué)方法】啟發(fā)式教學(xué)【教學(xué)工具】多媒體課件【教學(xué)過程】〔一〕引入課12套《天網(wǎng)》節(jié)目，截取其中法醫(yī)提取毛發(fā)，提取DNA進(jìn)展與嫌疑人比對的片段?！矎膶W(xué)生生疏的節(jié)目場景入手，激發(fā)他們心中疑心已久的探知興趣〕。師：法醫(yī)提取的毛發(fā)里面的DNA量是比較少的，要進(jìn)展比對需要大量的DNA樣品，也就是在比對之間是不是需要先對DNA進(jìn)展擴增？這就是咱們今日要學(xué)習(xí)的科技尖端的PCR技術(shù)，即：聚合酶鏈?zhǔn)椒错?，簡稱PCR〔英文全稱：PolymeraseChainReaction〕。等學(xué)完本課你們要告知我PCR技術(shù)還能應(yīng)用與什么領(lǐng)域？〔二〕課教學(xué)1．根底學(xué)問PCR技術(shù)擴增DNA的過程，與細(xì)胞內(nèi)DNA細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制條件分析：〔引導(dǎo)學(xué)生思考需要的條件，師生共同完成下表〕條件條件組分作用模板供給復(fù)制的模板原料四種脫氧核苷酸解旋酶酶能量ATP為解螺旋和合成子鏈供能引物RNADNA聚合酶供給合成的3’端起點DNA解 旋：解旋酶、ATP，DNA兩條鏈翻開，，形成兩條DNA單鏈。引物結(jié)合：在DNA3’端與DNA3’端與DNA對。DNA子鏈合成：DNA聚合酶從引物3’端開頭，將配對的脫氧核苷酸連接起來。后續(xù)加工：DNA聚合酶IDNA單鏈，再由DNA連續(xù)的DNA〔半不連續(xù)合成。先導(dǎo)鏈，滯后鏈〕子鏈合成特點：不能從頭合成；合成方向為“5’→3’合成”。DNADNADNADNA80～100℃時，DNA雙螺旋翻開，形成兩條DNA思考：為何不需要解旋酶？在生物體內(nèi)的溫存條件下就能使DNA的雙鏈解成單鏈。在DNA分子活化，當(dāng)在體外加熱到90oC—95oC，DNAPCR的基因不需要解旋酶。50℃左右時，兩條DNA復(fù)制條件：緩沖液,DNA模板,四種脫氧核苷酸,熱穩(wěn)定DNA思考：引物的作用是什么？DNARNA聚合酶在DNA的模板上合成一段RNA引物，再由DNA聚合酶從RNA3’端開頭合成的DNA鏈，產(chǎn)物片段的長度嚴(yán)格地限定在兩5’端之間，是需要擴增的特定片段。〔依據(jù)PCR〕反響場所：PCR［思考］緩沖液相當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的什么成分？PCR95℃時DNA50℃時引物與DNA72℃時合成DNA〔兩個引物間的序列〕72℃？Taq72℃左右才有最正確的活性。思考：一般進(jìn)展多少個循環(huán)？共有多少條PCR產(chǎn)物？25-30個循環(huán)最正確，過少產(chǎn)物量不夠，過多原料、能量等消耗殆盡。產(chǎn)物為225-230。PCR試驗操作PCR反響體系：緩沖液、DNA模板，四種脫氧核苷酸原料、熱穩(wěn)定DNA聚合酶、兩種RNA引物，水試驗操作步驟依據(jù)PCR反響體系配方配制反響液；將PCR50μL用微量移液器轉(zhuǎn)移到微量離心管〔0.5mL〕中；將微量離心管放到PCR儀中；設(shè)置PCR儀的工作參數(shù)。DNA在PCR儀中大量擴增。試驗留意事項避開外源DNA污染：所用儀器、緩沖液、蒸餾水等使用前高壓滅菌。緩沖液和酶分裝成小份，－20℃低溫保存。每添加一種反響成分，更換一個移液器的槍頭?；靹蚝箅x心處理，使反響液集中在離心管底部。結(jié)果分析與評價2μLPCR98μL100μL260nm處將分光光度計調(diào)整讀數(shù)為零。100μL260nm處的光吸取值。計算：DNA含量＝50×光吸取值×稀釋倍數(shù)〔三〕課堂總結(jié)、點評〔四〕實例探究例1在〔 〕的溫度范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋構(gòu)造解開A.10－20℃ B.80－100℃ C.20－30℃ D.40－60℃60－80℃的高溫，而DNA80℃以上才會變性。答案：B例2關(guān)于DNA的復(fù)制，以下表達(dá)正確的選項是〔 〕DNADNA5’端延長DNADNA引物與DNA母鏈通過堿基互補配對進(jìn)展結(jié)合DNA3’5’端延長解析：由于DNA聚合酶不能從頭開頭合成DNA，只能從引物的3’端即復(fù)制方向由3’端向5’端延長；由于DNADNA作用下合成的，其合成方向是從子鏈5’3’端延長。答案：C例3以下有關(guān)PCR描述，不正確的選項是〔 〕是一種酶促反響引物打算了擴增的特異性擴增產(chǎn)量按y＝〔1＋X〕n擴增對象是氨基酸序列擴增對象是DNA解析：PCR是一種體外快速擴增DNADNA氧核苷酸為原理，在引物的作用下使DNA聚合