精子功能檢測的進展課件

精子功能檢測的進展

南方醫(yī)科大學華銀醫(yī)學檢驗中心胡勇華精子功能檢測的進展

南方醫(yī)科大學華銀醫(yī)學檢驗中心胡勇1一、精子功能檢測的概要和意義二、精液常規(guī)顯微鏡檢查三、精子獲能和精子受精功能檢測四、精子核成熟度和精子染色體非整倍性檢測五、精子凋亡檢測六、精子功能流式細胞儀檢測的發(fā)展七、總結及展望內容一、精子功能檢測的概要和意義內容24.精子在女子生殖道獲能及運送1.數(shù)量2.活力3.形態(tài)5.精卵識別6.頂體反應7.釋放蛋白水解酶9.男子生殖核的形成

一、精子功能檢測的概要和意義

8.穿透透明帶4.精子在女子生殖1.數(shù)量2.活力3.形態(tài)5.精卵識別6.頂3WHO檢查指標：1、精液外觀2、精液量3、酸堿度4、液化時間5、粘稠度6、精子聚集與凝集7、精子濃度8、精子活動率9、圓細胞濃度及分類10、精子形態(tài)學染色分析二、精液常規(guī)顯微鏡檢查WHO檢查指標：二、精液常規(guī)顯微鏡檢查4精液常規(guī)檢查中容易忽略的幾個問題：1、精液標本的采集方式和患者的情緒會影響樣本采集的完整性。2、如果比較兩次的精液常規(guī)檢查結果，必須考慮相同的禁欲時間和患者相同的狀態(tài)。3、粘稠度高不等同于液化異常。不液化的精液標本呈現(xiàn)非均質粘稠，而粘稠度高的精液標本所呈現(xiàn)的是均質性粘性，并且其粘稠度不隨時間而變化。4、精子總數(shù)可以衡量睪丸產生精子的能力和男性輸精管道暢通的程度，精子濃度受精囊腺和前列腺分泌液量的影響（Eliassonetal.,1975），不是衡量睪丸功能的特異性指標。精液常規(guī)檢查中容易忽略的幾個問題：55、圓細胞濃度檢測和分類的重要性

精液中的白細胞和不成熟的生精細胞統(tǒng)稱為圓細胞。正常精液中，有90%的圓細胞為未成熟生精細胞，并且數(shù)量很少。

臨床檢測圓細胞濃度超過1x106/ml時，就需要進一步通過染色進行分類，并且準確測定它們的濃度，這對診斷不育病因十分重要。常用的染色方法有：區(qū)分不成熟生精細胞可以用瑞-吉染色；區(qū)分白細胞可以用白細胞過氧化物酶染色和全白細胞（CD45）免疫細胞化學染色。5、圓細胞濃度檢測和分類的重要性6精液中脫落生精細胞的形態(tài)示意圖（曹興午，精液生精細胞檢查與臨床意義，中華檢驗醫(yī)學雜志2006年10月第29卷第10期）精液中脫落生精細胞的形態(tài)示意圖7白細胞過氧化物酶染色的白細胞示意圖（棕色）白細胞過氧化物酶染色的白細胞示意圖（棕色）8全白細胞（CD45）免疫細胞化學染色結果示意圖全白細胞（CD45）免疫細胞化學染色結果示意圖9研究樣本情況睪丸活檢病理結果精液脫落細胞學檢查結果15例自愿者（均為妻子懷孕待產）可見各級生精細胞及精子1、能見少量各級生精細胞及大量精子者1例，占6.7%；2、見到少量初級精母細胞、次級精母細胞、精子細胞和大量精子者3例，占20%；3、見到少量次級精母細胞、精子細胞和大量精子者10例，占66.7%；4、僅見少量精子細胞和大量精子者1例，占6.7%。12例少精子癥者可見少量精原細胞、精母細胞、次級精母細胞，有少數(shù)晚期精子細胞1、檢查出包括精原細胞在內的大量各級生精細胞2例，占16.7%；2、有大量初級精母細胞、次級精母細胞、少量晚期精子細胞和精子8例，占66.7%；3、有大量精子細胞和極少量精子2例，占16.7%。10例原發(fā)性睪丸功能障礙1、僅見精原細胞、支持細胞6例；2、睪丸曲細精管生精細胞完全缺失，生精上皮僅支持細胞組成者4例。1、見有少量精原細胞、支持細胞及生殖道上皮細胞6例；2、見有支持細胞、生殖道上皮細胞4例。結論：精液脫落細胞學檢查與睪丸活檢的病理結果具有一致性。（黃宇峰，精液脫落細胞的研究與臨床應用，臨床檢驗雜志1996年第14卷第1期）研究樣本情況睪丸活檢病理結果精液脫落細胞學檢查結果15例自愿10

目前還沒有來自有生育力男性精液中過氧化物酶陽性細胞的參考范圍，WHO第四版精液分析手冊中確定的精液白細胞癥臨床診斷標準為>1x106/ml。Cooper通過研究證實現(xiàn)有的過氧化物酶染色方法很難精確到1x106/ml這個標準，所以白細胞精液癥臨界值的確定一直存在諸多分歧，因此臨床迫切需要建立新的標準和更可靠快速的檢測方法學。（Cooper,ImprovingPrecisionintheAssessmentofRoundCellNumbersinHumanSemen,2010）目前還沒有來自有生育力男性精液中過氧化物酶116、精子形體學分析必須按照嚴格標準進行評估

所謂嚴格標準，是指嚴格評估精子形態(tài)（細分為頭部、頸部和中段以及尾部）和過多殘留胞漿，只有以上標準都正常的精子才認為是正常的。

使用嚴格標準，精子頭部形狀比大小更重要。精子頭部形態(tài)異常往往和DNA碎片的增加（Gandinietal.,1988）、染色質結構異常（Leeetal.,1996）、不成熟染色質（Dadoumeetal.,1988）和非整倍體（Devillardetal.,2002）相關。卷尾可能提示附睪功能障礙（Pelfreyetal.,1982）。過多的殘留胞漿與精子的發(fā)育相關，并有研究顯示，活性氧(ROS)與過量的殘留胞漿小滴呈正相關（EsfandiariNetal.,2003）。6、精子形體學分析必須按照嚴格標準進行評估12精子形態(tài)學分類標準(Kruger&menkfeld)精子形態(tài)學分類標準(Kruger&menkfeld)13精液顯微鏡檢查技術的發(fā)展：1、計算機輔助精液常規(guī)分析系統(tǒng)（CASA）由相差顯微鏡、恒溫裝置、專用記數(shù)板、攝像系統(tǒng)、計算機分析處理系統(tǒng)及輸出系統(tǒng)組成。精液顯微鏡檢查技術的發(fā)展：142、精子DNA熒光染色CASA系統(tǒng)2、精子DNA熒光染色CASA系統(tǒng)153、活動精子細胞器形態(tài)學檢查(MSOME)技術和胞質內形態(tài)學選擇精子注射(IMSI)技術MSOME：高倍數(shù)光學顯微鏡，加上微分干涉相位差的光學技術，將精子放大到6300倍進行觀察，可以篩選出精子核、頂體后致密板、頂體、線粒體、頸部及尾部都正常的精子。IMSI：與常規(guī)ICSI比較，有更高的妊娠率和抱子回家率，而受精率、卵裂率和胚胎形態(tài)沒有明顯區(qū)。該技術需時較長，設備昂貴，加上需要有經驗的胚胎學家操作，胚胎學家的主觀性評判限制了其應用。3、活動精子細胞器形態(tài)學檢查(MSOME)技術和胞質內形態(tài)16總結：1、顯微鏡精液檢查技術可以獲得比較直觀精子形態(tài)數(shù)據(jù)，但無法揭示內在的原因；2、檢測過程受主觀因素影響較大，結果不穩(wěn)定；3、評估的精子數(shù)量有限，檢測的準確性有待商榷；4、無法滿足臨床自動化和批量化檢測的需要?？偨Y：17精子獲能檢測——精子的頂體反應三、精子獲能和受精功能檢測

精子獲能檢測——精子的頂體反應三、精子獲能和受精功能檢測

18三種檢測精子頂體反應的方法：1、鈣離子載體誘發(fā)精子頂體反應試驗；2、孕酮誘發(fā)精子頂體反應試驗；3、人卵透明帶誘發(fā)精子頂體反應試驗。其中，最準確的是人卵透明帶誘發(fā)精子頂體反應試驗，其它兩種方法檢測的結果與卵透明帶誘發(fā)的頂體反應不相關（Liu&Baker,1996）。三種檢測精子頂體反應的方法：1920精子誘發(fā)頂體反應(PSA-FITC標記)

（:發(fā)生頂體反應精子）20精子誘發(fā)頂體反應(PSA-FITC標記)精子受精功能檢測——精子與人卵透明帶相互結合與反應試驗（LiuDY&BakerHWG，1992）

該試驗被認為是至今為止最能準確預測IVF受精結局的試驗方法，但是由于需要使用人的卵子作為試驗載體，因而未能在臨床得到廣泛的使用。精子受精功能檢測——精子與人卵透明帶相互結合與反應試驗（L21+透明帶誘發(fā)頂體反應2hrs吸管精子-透明帶穿透試驗

精子-透明帶結合試驗精子與人卵透明帶相互結合與反應試驗+透明帶誘發(fā)頂體反應2hrs吸管精子-透明帶穿透試驗精子22研究樣本（600例）精子-透明帶結合異常透明帶誘發(fā)頂體反應低下精液常規(guī)檢查正常的不育患者13%28%中等精子畸形患者21%38%嚴重精子畸形患者31%48%少精子癥患者28%69%

無論是精子透明帶結合缺陷還是透明帶誘發(fā)精子頂體反應缺陷都會導致精子透明帶穿透能力的低下。

將精子能結合透明帶但不發(fā)生頂體反應，當然也不能穿透透明帶稱之為“透明帶誘發(fā)精子頂體反應缺陷癥（DZPIAR）”。

這類患者在IVF治療中的平均受精率<35%，大多數(shù)為完全受精失敗。通過實施ICSI會提高他們生育的機會。（LiuDY&BakerHWGetal.,Clinicalapplicationofsperm-oocyteinteractiontestsininvitrofertilizationembryotransferandintracytoplasmicsperminjectionprograms,FERTILITYANDSTERILITYVOL.82,NO.5,NOVEMBER2004）研究樣本（600例）精子-透明帶結合異常透明帶誘發(fā)頂體反應低23在精子核成熟過程中，由初期的組蛋白轉換成魚精蛋白，是精子核成熟的重要標志，也是最終形成高度濃縮的精子特異性染色質的重要前提。

精子核蛋白組型轉換障礙可能會干擾和阻礙魚精蛋白與DNA的相互作用，從而導致染色質縮合異常，進而引發(fā)核內空泡、頂體異常等精子形態(tài)的異常。四、精子核成熟度和精子染色體非整倍性檢測在精子核成熟過程中，由初期的組蛋白轉換成魚精24檢測精子核成熟度的方法有：1、苯胺藍染色法：操作簡單，為定性試驗。以核不成熟精子/核成熟精子+不成熟精子來反映精子核的成熟度。2、電泳法：操作復雜，為定量試驗。以總組蛋白/總精蛋白（TH/TP）以及人魚精蛋白1/人魚精蛋白2+人魚精蛋白3（HP1/HP2+HP3）的比值來評價精子核蛋白的成熟度。檢測精子核成熟度的方法有：25苯胺藍染色結果示意圖苯胺藍染色結果示意圖26精子功能檢測的進展ppt課件271050例男性不育患者精子核蛋白組型分析結論：精子核蛋白檢測有可能成為臨床評估男性生育力的重要指標。（陳暉等,1050例不育男性精子堿性核蛋白的分析,生殖醫(yī)學雜志2005年6月第14卷第3期）1050例男性不育患者精子核蛋白組型分析結論：精子核蛋白檢測28

國內學者研究了精子核蛋白成熟度與IVF結局之間的關系，發(fā)現(xiàn)精子核蛋白不成熟度與IVF受精率和正常受精率呈負相關性（r=-0.343、-0.253，P均<0.05），與卵裂率、優(yōu)質胚胎率無相關性（r=-0.04、-0.03，P均>0.05）（江莉等,精子核成熟度與體外受精結局的關系,山東醫(yī)藥2012年第52卷第19期）。有學者對315例自然流產婦女的配偶精子進行核蛋白成熟度檢測研究，發(fā)現(xiàn)精子核蛋白不成熟是孕早期自發(fā)性流產、胚胎停育的男性危險因素，但經藥物治療精子不成熟度得以改善后，可明顯減少女方自發(fā)流產／胚胎停育率和提高分娩率。（劉瑜等,孕早期自發(fā)性流產與胚胎停育男性因素病例對照研究,中國男科學雜志2010年第24卷）國內學者研究了精子核蛋白成熟度與IVF結局之29

精子染色體非整倍體是精子發(fā)生過程中減數(shù)分裂缺陷造成的細胞染色體數(shù)目異常。

熒光原位雜交（FISH）是檢測精子染色體非整倍體的主要方法之。精子染色體非整倍體是精子發(fā)生過程中減數(shù)分裂30

研究表明，不育男性染色體非整倍體的發(fā)生率比可育男性高10倍。精液常規(guī)檢查參數(shù)下降也會導致非整倍體精子發(fā)生率增加（VegettiWetal.,2000）。

回顧性研究表明，非整倍體精子與非整倍體兒的出生（或妊娠）相關（BlancoJetal.,1998；Martinezetal.,1999；CarrellDTetal.,2001）。

前瞻性研究表明，非整倍體精子含量高的男性產生非整倍體胚胎、非倍體胎兒或IVF失敗的風險增加（MartinRHetal.,1986；NagvenkarPetal.,2005；GianaroliLetal.,2005）。

復發(fā)性流產也與非整倍體精子的增加相關（RubioCetal.,1999）。研究表明，不育男性染色體非整倍體的發(fā)生率比31

細胞凋亡是細胞受遺傳機制控制，出現(xiàn)一系列形態(tài)功能的改變而自行結束生命的現(xiàn)象，是機體清除那些形態(tài)功能異常細胞的重要手段。

根據(jù)凋亡的過程可分為早期、中期和晚期凋亡，相應的檢測指標有：1、早期凋亡：細胞膜磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine,PS)的翻轉和線粒體膜電位去極化（MMP）；2、中期凋亡：Caspase（天門冬氨酸特異性蛋白酶,CP）酶系統(tǒng)的活化；3、晚期凋亡：DNA的碎片化（DNAFragment,DF）。五、精子與生精細胞凋亡檢測細胞凋亡是細胞受遺傳機制控制，出現(xiàn)一系列形態(tài)32細胞凋亡機制示意圖細胞凋亡機制示意圖33研究表明，正常生精過程中自發(fā)性和受到各種外來因素影響而誘發(fā)生精細胞減少大多與凋亡過程有關。（VigierMetal.,2004;KilincFetal.,2004;JMorettiEetal.,2007;TheasMSetal.,2006;AssinderSetal.,2007）。

生精細胞凋亡發(fā)生在三個階段：首先是在A型精原細胞的有絲分裂階段；其次是精母細胞的減數(shù)分裂階段；最后是精子的形成階段。

生精細胞凋亡的意義在于維持精子發(fā)生過程的動態(tài)平衡，維持支持細胞與生精細胞的最佳比例，清除異常生殖細胞，調節(jié)生精過程中精子的數(shù)量和質量。在病理狀態(tài)下，生精細胞凋亡則導致少精子或無精子癥發(fā)生。（KilincFetal.,2004;JMorettiEetal.,2007;TheasMSetal.,2006;AssinderSetal.,2007）研究表明，正常生精過程中自發(fā)性和受到各種外來34

成熟精子的凋亡主要發(fā)生在精子離開睪丸后的階段。誘發(fā)精液中精子凋亡的主要因素是活性氧（ROS）損傷。

人精液中的活性氧物質由精子和白細胞產生。

精子內源性的活性氧物質主要來自線粒體分泌的過氧化氫，外源性活性氧物質主要是超氧陰離子。（Aitken&West,1990;Alvarezetal.,1987;Iwasaki&Gagnon,1992）成熟精子的凋亡主要發(fā)生在精子離開睪丸后的階段。35

現(xiàn)有的研究表明精液中精子凋亡率與精子濃度、精子前向活動率、精子形態(tài)呈顯著負相關性，而與精子的活率無顯著相關性，是少精子癥、弱精子癥和畸形精子癥形成的重要因素（GandiniLetal.,2000;

ChenZetal.,2006;ZhangHBetal.,2008;LvYiQingetal.,2009）

較高的凋亡指標檢測水平已經被證實與精子穿透卵母細胞的能力呈負相關性。與正常能穿透卵母細胞的精子相比，低穿透能力的精子往往含有很高的凋亡率（Grunewaldetal.,2008）。現(xiàn)有的研究表明精液中精子凋亡率與精子濃度、精子36精子凋亡指標的流式細胞儀檢測方法：PS翻轉：AnnexinV-FITC/PI檢測精子凋亡指標的流式細胞儀檢測方法：37MMP：JC-1檢測陰性對照陽性結果MMP：JC-1檢測陰性對照陽性結果38凋亡中期：CP3活化率檢測凋亡中期：CP3活化率檢測39凋亡晚期（精子DNA碎片化）：1、TUNEL（脫氧核糖核酸N末端標記法）檢測2、SCSA（精子染色質結構分析法）檢測凋亡晚期（精子DNA碎片化）：40SCSA檢測結果示意圖（EvensonPDetal.,SpermChromatinStructureAssay:ItsClinicalUseforDetectingSpermDNAFragmentationinMaleInfertilityandComparisonsWithOtherTechniques,JournalofAndrology,2002）SCSA檢測結果示意圖（EvensonPDetal.,41SCSA評估精子DNA碎片化的指標：1、HDS：精子DNA高染性指數(shù)，代表精子染色質結構的致密性。HDS>10%，表示染色質結構不致密，精子DNA容易損傷，與核蛋白的組型轉換相關。2、DFI：精子DNA碎片化指數(shù)，代表精子DNA的損傷率。DFI≤15%：表示DNA碎片含量低，具有生育的潛能；16%<DFI≤30%：表示DNA碎片含量中等，存在一定的不育風險；DFI≥30%：表示DNA碎片含量高，生育潛能低下。SCSA評估精子DNA碎片化的指標：42精子DNA碎片化檢測的意義：1、不育、自發(fā)流產、胚胎停育病因分析2、妊娠結局的預測3、輔助生殖助孕方式的選擇精子DNA碎片化檢測的意義：43精子功能檢測的進展ppt課件44（LaraTamburrinoetal.,MechanismsandclinicalcorrelatesofspermDNADamage,AsianJournalofAndrology(2012)14,24–31）近幾年國外對精子DNA碎片化研究情況匯總表（LaraTamburrinoetal.,Mecha454646精子DNA碎片檢測與ART選擇4646精子DNA碎片檢測與ART選擇47精子DNA碎片與IVF/ICSI關系47精子DNA碎片與IVF/ICSI關系我中心采用SCSA方法對經體外密度梯度離心純化前后的精子DFI和HDS進行了研究，發(fā)現(xiàn)處理后HDS明顯降低，而DFI在HDS<5%時，會明顯降低，當處理前精子HDS>5%時，會明顯升高。說明體外精子優(yōu)化處理對精子DNA損傷的程度因精子染色質致密程度不同而不同。因此在實施IVF或者ICSI時，應檢測精子的DFI和HDS。對于那些不成熟較高的精子，應考慮使用其它的體外優(yōu)化方法，以免對精子DNA產生損傷，降低流產風險。我中心采用SCSA方法對經體外密度梯度離心純48DFI正常結果示意圖DFI異常結果示意圖南方醫(yī)科