進出口食品中耐熱大腸菌群快速計數(shù)法

《出口貝類中大腸菌群、糞大腸菌群檢測方法》編制說明1.任務來源根據(jù)國家出入境檢驗檢疫總局2011年下達的標準編寫任務通知（計劃編號：2011B145），由福建出入境檢驗檢疫局主持中華人民共和國國家出入境檢驗檢疫行業(yè)標準《出口貝類中大腸菌群、糞大腸菌群檢測方法》的編制起草工作。2.目的和意義貝類，多指軟體動物門中的瓣鰓綱（或雙殼綱）動物，一般體外披有1~2塊貝殼，常見的有牡蠣、貽貝、蛤、蟶等。由于貝類生長位置較穩(wěn)定，一旦遇到污染，很難回避；且貝類多屬于濾食型生物，在進食食物的同時，也將水中的有毒有害物質吸入體內。隨著近海沿岸水域人類活動的日益頻繁，近幾年貝類受到到大腸菌群、糞大腸菌群污染的事件時有報道。大腸菌群、糞大腸菌群作為常用的指標菌，被廣泛應用于各類水產品的檢驗。目前，系統(tǒng)內尚無專門針對貝類中大腸菌群、糞大腸菌群檢測的標準方法。因此本制標項目將在現(xiàn)有的相關國家標準和檢驗檢疫行業(yè)標準的基礎上，參考國外相關檢測方法，研究制定貝類（及其產品）適用的大腸菌群、糞大腸菌群檢測方法，以適應日益增長的技術執(zhí)法中對貝類中大腸菌群、糞大腸菌群檢測的需要?！柏愵愔写竽c菌群、糞大腸菌群檢測方法”目前無相同的國家標準和行業(yè)標準，我國現(xiàn)行的國家標準“食品衛(wèi)生微生物學檢驗水產食品檢驗”（GB/T4789.20-2003）未規(guī)定糞大腸菌群檢測方法，“鮮、凍動物性水產品衛(wèi)生標準”（GB2733-2005）、“出口活貝類檢驗規(guī)程”（SN/T0375-1995）等相關國家行業(yè)標準也未就貝類中大腸菌群、糞大腸菌群檢測方法進行規(guī)定。本制標項目將現(xiàn)有的相關國家標準和檢驗檢疫行業(yè)標準的基礎上，參考國外相關檢測方法，結合多年來國家標準、行業(yè)標準實際應用情況，吸收新的檢測技術或手段，研究制定新的貝類中大腸菌群、糞大腸菌群檢測方法，并進行驗證和編制。3制標依據(jù)本標準按照GB/1.1-2000《標準化工作導則第1部分：標準的結構和編寫規(guī)則》的要求進行編寫。其中技術路線參照美國食品藥品管理局（FDA）《細菌分析手冊》第4章大腸桿菌和大腸菌群計數(shù)（2002年）（BacteriologicalAnalyticalManual，Chapter4:EnumerationofEscherichiacoliandthecoliformbacteria,2002）進行修改。引用了如下標準的部分內容：GB/T4789.20食品衛(wèi)生微生物檢驗水產食品檢驗GB17378.7海洋監(jiān)測規(guī)范第3部分：樣品采集、貯存與運輸SN/T1538.1培養(yǎng)基制備指南第1部分：實驗室培養(yǎng)基制備質量保證通則SN/T1538.2培養(yǎng)基制備指南第2部分：培養(yǎng)基性能測試實用指南參考比較了GB4789.3《食品微生物學檢驗大腸菌群計數(shù)》、GB4789.39《食品衛(wèi)生微生物學檢驗糞大腸菌群計數(shù)》以及GB17378.27《海洋監(jiān)測規(guī)范第7部分：近海污染生態(tài)調查和生物監(jiān)測》等方法，制訂適用貝類的大腸菌群、糞大腸菌群檢測方法。4研究過程在建立了本方法（以下稱其為“貝類大腸菌群、糞大腸菌群檢測法”）后，對其進行了方法驗證。方法驗證包括兩部分：室內方法比較研究和室間協(xié)作試驗。4.1室內方法比較研究以檢測人工污染相同濃度添加菌樣品的方式，比較了貝類大腸菌群、糞大腸菌群檢測方法采取200g取樣量及5管接種培養(yǎng)法，與通常食品中25g取樣量及3管接種法的差異；同時，還研究了貝類大腸菌群、糞大腸菌群相對準確性和特異性。大腸菌群、糞大腸菌群作為衛(wèi)生指示菌達到一定數(shù)量才表明貝類衛(wèi)生狀況差，貝類中檢測出的大腸菌群、糞大腸菌群數(shù)如果很低并沒有多少實際意義，因此未進行該方法的檢出限研究。4.2室間協(xié)作試驗組織了6個實驗室，其中包括一家生產出口貝類產品的企業(yè)實驗室，采用1種貝類樣品，3個污染水平的實驗室間協(xié)作實驗，確定了本方法的重復性值和再現(xiàn)性值。5研究內容5.1室內方法比較研究5.1.1取樣量及接種培養(yǎng)法的比較本方法對貝類樣品的取樣量為200g，采用5管法接種培養(yǎng)，不同于通常食品25g的取樣量，采用3管接種培養(yǎng)。采用相同濃度的人工污染貝類樣品，按兩種不同取樣量、不同的接種管數(shù)進行檢測，比較檢測大腸菌群、糞大腸菌群結果的差異。方法5.1.1.1.1基質：經過熱處理的花蛤、貽貝樣品，剝去雙殼取蛤肉及殼瓣內液體均質（不加稀釋液），經菌落總數(shù)測定為不含菌的陰性樣品。5.1.1.1.2菌株：大腸埃希氏菌ATCC25922購自上海漢尼公司。將冷凍保存的大腸埃希氏菌菌株置室溫回溫后，接種于營養(yǎng)肉湯中制成菌懸液，至36.5°C培養(yǎng)18?24h，取1mL菌液肉湯加入9mL稀釋液制成1/10的菌液稀釋液后，按1/10做成系列稀釋度，選擇合適系列稀釋度的菌懸液備用。5.1.1.1.3接種水平：用上述菌懸液的合適濃度的稀釋液分別接種2種貝類基質，每種貝類按101?102CFU/mL、102?103CFU/mL、104?105CFU/mL分別接種3個樣品，每個樣品為225g，經過均質混勻后，分成200g、25g待檢。5.1.1.1.4分析：按貝類大腸菌群、糞大腸菌群檢測方法，取樣量為200g，采用5管法；另外，按通常的取樣量為25g，采用3管法。比較兩種不同取樣量、不同的接種管數(shù)檢測結果的差異。檢測結果見下表。表1比較兩種不同取樣量及不同接種管數(shù)培養(yǎng)法的檢測結果污染水平取樣量、接種法花蛤貽貝檢測結果（MPN/g）檢測結果（MPN/g）低200g，5管法1308025g，3管法12075中200g，5管法940180025g，3管法4302100200g，5管法54003400

高25g，3管法43001500t值t=1.784<(t005=%571)P值P>0.05'從對兩種人工污染樣品三個接種水平兩種取樣量計數(shù)結果可以看出，兩種方法所得結果經統(tǒng)計學處理，無顯著差異，從檢測結果來看，取樣量為200g的檢測數(shù)值大部分大于取樣量為25g的檢測數(shù)值，說明取樣量大檢出的菌量會相對多點，也可能與試驗樣本數(shù)不夠多有關系。5.1.2相對準確性方法2.1實驗菌株菌液制備采用5.1.1.1制備的基質，分別稱取四份各200g花蛤肉均質待用。添加菌液制備同5.1.1.2，將過夜培養(yǎng)的菌懸液，10倍遞增稀釋至所需濃度（本實驗采用10-6、10-7、10-8、10-9四種稀釋度），每個稀釋度取1mL分別添加到四份200g花蛤肉中均質混勻，分成四組，按照貝類大腸菌群、糞大腸菌群檢測法檢測，同時用常用的3管法計數(shù)所添加菌液含菌量。結果表2大腸菌群數(shù)量的檢測結果組別貝類大腸菌群檢測方法所添加菌液含菌量陽性反應管數(shù)MPN（每克）陽性反應管數(shù)MPN（每克/毫升）95%可信限1g0.1g0.01g1g0.1g0.01g下限上限155416033211018410554160553925539255254254222322214435422254117543285321434313.321120.454.24323.44101.73412.44403.44000<0.2000<0.3—0.95000<0.2

000<0.2000<0.2000<0.2由于只添加大腸埃希氏菌1種菌，糞大腸菌群的檢測結果與大腸菌群的檢測結果基本一致，不再單獨列表說明。以上試驗選用凍煮花蛤作為人工污染樣品基質，用傳統(tǒng)3管法對添加到蛤肉中的菌液含大腸埃希氏菌的量進行計數(shù)，同時，采用貝類大腸菌群、糞大腸菌群檢測法檢測人工污染貝類中的菌量。從以上幾種濃度菌液的計數(shù)結果可以看出，用該方法所得計數(shù)結果，基本落在所添加菌液含菌量的95%可信限范圍內，因此，采用該方法能夠準確檢測出貝類中所含的大腸菌群、糞大腸菌群的數(shù)量。5.1.3特異性方法選取15株大腸菌群菌株和25株非大腸菌群菌株，將40株菌分別接種到經過熱處理為不含菌的40份花蛤樣品中，接種水平約為102cfu/mL，采用貝類大腸菌群檢測法，按取樣量與稀釋液之比為1：2的比例混勻，各取2mL加入10mL雙料LST管中，共接5管，只要5管中有一管產酸產氣并經過BGLB證實，說明所添加的菌能夠被檢出判定為陽性，反之為未檢出判定為陰性。結果貝類大腸菌群檢測法的特異性見表3。表3貝類大腸菌群檢測法特異性研究菌株中文名菌株學名菌株號菌株來源結果大腸埃希氏菌EscherichiacoliATCC25922購自上海漢尼公司陽性大腸埃希氏菌EscherichiacoliATCC8739?？箯S提供陽性大腸埃希氏菌Escherichiacoli44110購自中國藥品生物制品檢定所陽性大腸埃希氏菌Escherichiacoli44155購自中國藥品生物制品檢定所陽性大腸埃希氏菌Escherichiacoli44106購自中國藥品生物制品檢定所陽性大腸埃希氏菌Escherichiacoli44103購自中國藥品生物制品檢定所陽性大腸埃希氏菌EscherichiacoliATCC10536購自陸橋公司陽性大腸埃希氏菌EscherichiacoliCC008本室分離菌株陽性阪崎腸桿菌EnterobactersakazakiiATCC29544購自陸橋公司陽性阪崎腸桿菌EnterobactersakazakiiATCC51329購自上海漢尼公司陽性阪崎腸桿菌EnterobactersakazakiiATCC50205上海局提供陽性肺炎克雷伯氏菌Klebsiellapneumoniae46117購自中國藥品生物制品檢定所陽性

肺炎克雷伯氏菌KlebsiellapneumoniaeATCC4352購自上海漢尼公司陽性產酸克雷伯氏菌KlebsiellaoxytocaATCC700324生物梅里埃公司提供陽性陰溝腸桿菌EnterobactercloacaeCC031本室分離菌株陽性弗氏檸檬酸桿菌CitrobacterfreundiiATCC8090購自上海漢尼公司陰性弗氏檸檬酸桿菌CitrobacterfreundiiCC029本室分離菌株陰性布氏檸檬酸桿菌CitrobacterbraakiiCC012本室分離菌株陰性普通變形菌ProteusvulgarisATCC49132購自上海漢尼公司陰性奇異變形菌ProteusmirabilisATCC43072購自上海漢尼公司陰性奇異變形菌ProteusmirabilisCC010本室分離菌株陰性遲鈍愛德華氏菌EdwardsiellatardaATCC15947購自上海漢尼公司陰性甲型副傷寒沙門氏菌SalmonellaparatyphiACC002福建CDC提供陰性豬霍亂沙門氏菌SalmonellacholeraesuisATCC13311?？箯S提供陰性鼠傷寒沙門氏SalmonellatyphimuriumATCC14028購自上海漢尼公司陰性腸炎沙門氏菌SalmonellaenteritidisATCC13076購自上海漢尼公司陰性腸炎沙門氏菌Salmonellaenteritidis5041購自中國藥品生物制品檢定所陰性浦那沙門氏菌SalmonellapoonaNCTC-4840購自上海漢尼公司陰性宋內氏志賀氏菌ShigellasonneiATCC25931購自上海漢尼公司陰性痢疾志賀氏菌Shigelladysenteriae51252購自中國藥品生物制品檢定所陰性蠟樣芽孢桿菌BacilluscereusATCC11778購自上海漢尼公司陰性副溶血性弧菌VibrioparahaemolyticusATCC17802購自上海漢尼公司陰性副溶血性弧菌Vibrioparahaemolyticus1.1997購自中科院微生物所菌種中心陰性溶血性鏈球菌Streptococcushemolytics33210-4a購自中國藥品生物制品檢定所陰性銅綠假單胞菌PseudomonasaeruginosaATCC27853購自上海漢尼公司陰性金黃色葡萄球菌StaphylococcusaureusATCC6538?？箯S提供陰性表皮葡萄球菌StaphylococcusepidermidisATCC12228?？箯S提供陰性單增李斯特氏菌ListeriamonocytogenesATCC7644購自上海漢尼公司陰性英諾克李斯特ListeriainnocuaATCC33090購自上海漢尼公司陰性氏菌購自中科院微生物所 陰性糞腸球菌Enterococcusfaecalis1.013購自中科院微生物所 陰性菌種中心從上表可以看出，采用貝類大腸菌群、糞大腸菌群檢測法，對貝類中添加的15株大腸菌群菌株均能夠檢出，對貝類中添加的25株非大腸菌群菌株均未檢出，說明本方法特異性為100%。5.2室間協(xié)作試驗5.2.1室間協(xié)作試驗通知進行協(xié)作試驗之前向各實驗室發(fā)送“《出口貝類中大腸菌群、糞大腸菌群檢測方法》室間協(xié)作實驗的通知”，說明協(xié)作試驗目的、內容、時間安排等信息。5.2.2測試樣品5.2.2.1樣品基質本次試驗樣品基質選用經過熱處理的文蛤，將文蛤去殼，取蛤肉及殼瓣內液體均質(不加稀釋液)，并用平板計數(shù)法檢查文蛤中大腸菌群、糞大腸菌群數(shù)，確定該樣品里不含有的大腸菌群、糞大腸菌群數(shù)。將均質好的文蛤樣品分裝到無菌樣品瓶中，每瓶分裝200g均質樣品。菌株大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)ATCC25922和弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)ATCC8090購自上海漢尼公司，大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)44110購自中國藥品生物制品檢定所。將這3株菌分別接種在平板計數(shù)瓊脂平板上，37°C過夜培養(yǎng)。從平板上取菌混和于磷酸鹽緩沖液(Butterfield’sbufferedphosphatediluent)中，制備成混合菌懸液，然后用磷酸鹽緩沖液進行10倍系列稀釋。5.2.2.3人工污染樣品貝類樣品制成高、中、低三個污染水平的樣品。將裝有已均質好的蛤肉的樣品瓶分成3組，選取3個不同濃度的菌懸液等量添加到三個樣品基質中，每瓶添加的菌液為1mL，混勻。制備好的樣品的污染水平大致為：高污染濃度約為104MPN/g(mL)?105MPN/g(mL)，中污染濃度約為102MPN/g(mL)?103MPN/g(mL)，低污染濃度約為10】MPN/g(mL)?102MPN/g(mL)。樣品制備好，編號后立即放于冰箱冷凍保存。5.2.3參加實驗室邀請了檢驗檢疫系統(tǒng)、福建CDC、水產品加工企業(yè)的微生物檢測實驗室共6個作為參加實驗室，實驗室編號為1?6。5.2.4樣品分發(fā)每個實驗室接收到3份樣品，樣品標記為樣品1、樣品2、樣品3。發(fā)送樣品時，從冰箱中取出樣品用泡沫保溫盒(內有冰袋)包裝，一早用快遞寄往參加實驗室，隨樣品寄送“室間協(xié)作試驗作業(yè)指導書”。樣品抵達實驗室后，立即放于冰箱冷凍保存，直至約定的檢測日期。5.2.5樣品檢測6個實驗室按照“室間協(xié)作試驗作業(yè)指導書”的要求在約定日期同時開始檢測樣品。每個實驗室采用貝類大腸菌群、糞大腸菌群檢測法檢測3份樣品中的大腸菌群、糞大腸菌群。5.2.6協(xié)作試驗數(shù)據(jù)分析檢測結果記錄在統(tǒng)一的記錄表上，交給本次協(xié)作試驗組織者。全部檢測結果數(shù)據(jù)轉化成以10為底的對數(shù)再用于統(tǒng)計分析。5.2.7結果和討論6個實驗室參加了此次協(xié)作試驗，按照規(guī)定的時間，檢測了3份樣品。檢測結果見表4,統(tǒng)計分析結果見表5。 表4貝類樣品中大腸菌群、糞大腸菌群協(xié)作試驗結果 樣品1（低污染） 樣品2（中污染）實驗 大腸菌群 糞大腸菌群 大腸菌群 糞大腸菌群 大，室編結果值對數(shù)值結果值對數(shù)值結果值對數(shù)值結果值對數(shù)值結果值號（MPN/g） （MPN/g） （MPN/g） （MPN/g） （MPN/g1391.59221.349402.974602.66280002261.41211.324902.692302.36240003341.53221.346302.803302.52350004241.38211.3212003.087002.85920005321.51261.417902.904802.6