轉(zhuǎn)基因植物課件

植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)1轉(zhuǎn)基因植物技術(shù)是指利用基因工程技術(shù)，在離體條件下，對不同生物的DNA進(jìn)行加工，并按照人們的意愿和適當(dāng)?shù)妮d體重新組合，再將重載體轉(zhuǎn)入受體中，并使其在體內(nèi)表達(dá)的植物。轉(zhuǎn)基因植物通常具有高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、抗病蟲、環(huán)境抗性、抗除草劑、耐儲存、提高某些成分的含量等優(yōu)良性狀。轉(zhuǎn)基因植物技術(shù)是指利用基因工程技術(shù)，在離體條件下，對不同生物2

1.植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的基本路線2.農(nóng)作物基因工程（抗蟲、抗病毒﹑抗除草劑﹑轉(zhuǎn)基因作物，提高作物產(chǎn)量與品質(zhì)）1.植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的基本路線3二、植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的基本路線1.目的基因的分離2.載體構(gòu)建3.導(dǎo)入細(xì)菌并利用細(xì)菌繁殖擴(kuò)增重組DNA4.對植物組織或細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化5.植株再生6.轉(zhuǎn)基因植株的鑒定7.轉(zhuǎn)基因植株的種植二、植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的基本路線1.目的基因的分離4(一)目的基因的獲取

1、從基因文庫中獲取目的基因2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因3、化學(xué)方法人工合成(一)目的基因的獲取

1、從基因文庫中獲取目的基因5二.基因表達(dá)載體的構(gòu)建-----------核心二.基因表達(dá)載體的構(gòu)建-----------核心6基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程質(zhì)粒DNA分子限制酶處理兩個切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種一個切口兩個黏性末端基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程質(zhì)粒DNA分子限制酶處理兩個切口DNA7三、外源基因?qū)胫参锏姆椒ǎㄒ唬〥NA直接轉(zhuǎn)移法

1）化學(xué)刺激法

PEG、PNA（肽核酸）、磷酸鈣、氯化鈣等化學(xué)試劑等處理原生質(zhì)體，可使其捕獲外源DNA。

2）電擊法

在適當(dāng)?shù)耐饧与妷合?，?xì)胞膜可能被擊穿，使得外源DNA容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。原生質(zhì)體不受傷害，而且膜孔可恢復(fù)。三、外源基因?qū)胫参锏姆椒ǎㄒ唬〥NA直接轉(zhuǎn)移法83）顯微注射法

借助顯微注射儀，將外源DNA通過機(jī)械方法直接注射到受體細(xì)胞。4）基因槍法基因槍法，也稱微粒轟擊法，是將DNA包被到金?；蜴u粒中然后把這些粒子加速推進(jìn)靶細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn)是轉(zhuǎn)化受體迅速簡單、取材廣泛，不受基因型限制，金屬微粒的噴射面廣，植株可育性高，轉(zhuǎn)化頻率高等。5）脂質(zhì)體介導(dǎo)法

是將DNA或RNA包裹于脂質(zhì)體內(nèi)，然后進(jìn)行脂質(zhì)體與細(xì)胞膜的融合，通過融合導(dǎo)入細(xì)胞。3）顯微注射法96）微激光束法利用激光微束脈沖引起細(xì)胞膜可逆穿孔，從而將外源DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。7）花粉通道法

將外源DNA片段在自花授粉后的特定時期注入柱頭或花柱，外源DNA沿花粉管通道或傳遞組織通過珠心進(jìn)入胚囊，轉(zhuǎn)化不具備細(xì)胞壁的受精卵，合子或早期胚體細(xì)胞。6）微激光束法10人們很早就發(fā)現(xiàn)雙子葉植物常發(fā)生一種冠癭瘤病，該病在法國、東歐和意大利的葡萄和果樹上曾大面積發(fā)生。1907年Smith和Townsent等首先發(fā)現(xiàn)這種冠癭瘤病是由根癌農(nóng)桿菌引發(fā)的。（二）農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒與植物遺傳轉(zhuǎn)化人們很早就發(fā)現(xiàn)雙子葉植物常發(fā)生一種冠癭瘤11農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒與植物遺傳轉(zhuǎn)化1974年Zaenen等在根癌農(nóng)桿菌內(nèi)發(fā)現(xiàn)并分離了一種與腫瘤誘導(dǎo)有關(guān)的大型質(zhì)粒（大于200kb），稱為Ti質(zhì)粒。1977年Chilton等在研究農(nóng)桿菌侵染后形成的植物腫瘤細(xì)胞時，用分子雜交發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中存在著農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的一個片段，稱為T-DNA（Transfer-DNA）。實(shí)驗(yàn)表明，T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞后整合進(jìn)植物基因組中并得以表達(dá)，從而導(dǎo)致了冠癭瘤的發(fā)生。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，整合到植物基因組中的T-DNA可以通過減數(shù)分裂穩(wěn)定地傳給植物的后代，Ti質(zhì)粒的上述特性成為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法植物遺傳轉(zhuǎn)化的重要基礎(chǔ)。農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒與植物遺傳轉(zhuǎn)化1974年Zaenen等在根癌12Ti質(zhì)粒為根癌農(nóng)桿菌核外的一種環(huán)狀雙鏈DNA分子，長約200Kb。其中含有一段稱為T-DNA的可轉(zhuǎn)移區(qū)段，當(dāng)農(nóng)桿菌侵染寄主細(xì)胞后，T-DNA可以從農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移到寄主細(xì)胞內(nèi)并整合到寄主細(xì)胞的基因組中。Ti質(zhì)粒的這一特性為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法植物轉(zhuǎn)基因奠定了基礎(chǔ)。T-DNA的長約23Kb，在其兩端各有一個25bp左右的正向重復(fù)序列，稱之為T-DNA的邊界序列。在不同的農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上該序列高度保守，一般認(rèn)為右端重復(fù)序列對T-DNA的轉(zhuǎn)移起決定性作用。農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒與植物遺傳轉(zhuǎn)化Ti質(zhì)粒為根癌農(nóng)桿菌核外的一種環(huán)狀雙鏈DNA分子，長約20013將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞----農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞----農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

14葉盤消毒切取土壤農(nóng)桿菌浸泡篩選培養(yǎng)基愈傷組織分化幼苗葉盤消毒切取土壤農(nóng)桿菌浸泡篩選培養(yǎng)基愈傷組織分化幼苗15四、轉(zhuǎn)基因植物的篩選與檢測

無論使用哪種轉(zhuǎn)基因方法，轉(zhuǎn)化細(xì)胞與非轉(zhuǎn)化細(xì)胞相比都只占少數(shù)。為獲得真正的轉(zhuǎn)基因植株，進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化后的第一步工作是篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞。在含有選擇壓力的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化細(xì)胞分化，形成轉(zhuǎn)化芽，再誘導(dǎo)芽生長、生根，形成轉(zhuǎn)化植株。第二步是對轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。第三步則是進(jìn)行性狀鑒定及外源基因的表達(dá)調(diào)控研究。四、轉(zhuǎn)基因植物的篩選與檢測無論使16報(bào)告基因報(bào)告基因是用來篩選和指示轉(zhuǎn)化細(xì)胞，組織和轉(zhuǎn)基因植物的有效標(biāo)記。根據(jù)報(bào)告基因編碼特點(diǎn)，分為兩類，抗性基因和編碼催化人工底物產(chǎn)生顏色變化的酶基因或發(fā)光基因。報(bào)告基因由于其表達(dá)產(chǎn)物易于檢測，已廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物中。報(bào)告基因171.（一）抗性基因一般用抗性基因來富集轉(zhuǎn)化細(xì)胞。抗性基因應(yīng)滿足以下幾點(diǎn)：1.抗性基因應(yīng)是顯性基因。2.在選擇壓力下，轉(zhuǎn)化細(xì)胞能繼續(xù)生長，而非轉(zhuǎn)化細(xì)胞受到抑制，從而使轉(zhuǎn)化子得到富集。3.抗性基因產(chǎn)物本身不能對轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長或發(fā)育有抑制作用。4.選擇物價廉易得。1.（一）抗性基因一般用抗性基因來富181.抗生素抗性基因1.npt

新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，對卡那霉素、巴龍霉素、新霉素具有抗性。2.aphIV潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，對潮霉素具有抗性。3.spt鏈霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，對鏈霉素具有抗性。4.cat氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，使氯霉素喪失抗生素活性。等等。1.抗生素抗性基因1.npt新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，對卡那霉192.抗除草劑基因除草劑抗性基因在植物遺傳轉(zhuǎn)化中可同時用作選擇標(biāo)記和培養(yǎng)抗除草劑的作物?？钩輨┗蛑饕锌筆PT的bar和pat基因以及抗草甘膦的epsps基因。2.抗除草劑基因除草劑抗性基因在植物遺傳轉(zhuǎn)化中可同時用作選擇20（二）顯色或發(fā)光報(bào)告基因1.GUS基因2.熒光素酶基因3.GFP基因報(bào)告基因僅用于篩選轉(zhuǎn)化體，因?yàn)閳?bào)告基因是在染色體上，只能間接證明目的基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，要獲得目的基因轉(zhuǎn)化及表達(dá)的直接證據(jù)，還需要進(jìn)行生物學(xué)檢測。（二）顯色或發(fā)光報(bào)告基因1.GUS基因212.分子生物學(xué)檢測方法1.酶聯(lián)免疫吸附檢測酶聯(lián)免疫吸附檢測是指利用外源基因表達(dá)蛋白的抗體與抗原的特異性，通過結(jié)合在抗體上的酶作用于特定的底物后發(fā)生顯色反應(yīng)，借助比色鑒定轉(zhuǎn)基因植物?？山?jīng)免疫反應(yīng)確定表達(dá)蛋白在轉(zhuǎn)基因植物組織及細(xì)胞中的分布。2.分子生物學(xué)檢測方法1.酶聯(lián)免疫吸附檢測222.PCR技術(shù)檢測是根據(jù)轉(zhuǎn)基因植物中外源基因的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成相應(yīng)的引物，以轉(zhuǎn)基因植物DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。如PCR擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物與外源基因片段相同，表明該植物為轉(zhuǎn)基因植物。PCR檢測DNA用量少，操作簡單，快速靈敏，不需用同位素即可完成。應(yīng)用PCR檢測易出現(xiàn)假陽性，可用PCR－Southern雜交進(jìn)一步驗(yàn)證。2.PCR技術(shù)檢測233.分子雜交檢測利用探針與其互補(bǔ)的核苷酸序列雜交后，就可以從諸多的核苷酸序列中檢測出與其互補(bǔ)的序列，因而分子雜交是重組子鑒定以及檢測外源基因整合與表達(dá)的強(qiáng)有力的手段。它是證明外源基因在植物染色體上整合的最可靠方法。轉(zhuǎn)基因植物分子雜交包括兩部分，一是核酸分子雜交，其中又包括Southern雜交及Northern雜交。二是屬于蛋白質(zhì)分子“雜交”的western雜交。3.分子雜交檢測24一、抗病蟲害的轉(zhuǎn)基因植物將抗蟲基因?qū)朕r(nóng)作物是植物基因工程的得意之筆，能避免化學(xué)殺蟲劑所造成的許多負(fù)面影響。目前，抗蟲作物已占全球轉(zhuǎn)基因作物的22％。用于構(gòu)建抗蟲害轉(zhuǎn)基因植物常見的外源基因有蘇云金芽孢桿菌的毒晶蛋白基因、蛋白酶抑制劑基因、淀粉酶抑制劑基因、凝集素基因、脂肪氧化酶基因、幾丁質(zhì)酶基因、蝎毒素、蜘蛛毒素基因等40多個，其中毒晶蛋白基因、蛋白酶抑制劑基因和凝集素基因應(yīng)用最為廣泛。一、抗病蟲害的轉(zhuǎn)基因植物將抗蟲基因?qū)朕r(nóng)作物是植物基因工程25二.抗蟲轉(zhuǎn)基因植物蘇云金桿菌（Bt）毒素蛋白基因有四種：I,II,III,IVI型毒素蛋白抗鱗翅目昆蟲II型毒素蛋白抗鱗翅目核雙翅目昆蟲III型毒素抗鞘翅目昆蟲IV型毒素抗雙翅目昆蟲二.抗蟲轉(zhuǎn)基因植物蘇云金桿菌（Bt）毒素蛋白基因有四種：I,26三.抗除草劑作物谷氨酰胺合成酶GS在植物的氨同化及氮代謝過程中起重要的作用，對氨具有很高的親和力，是植物體內(nèi)唯一能夠解除由硝酸鹽還原、氨基酸代謝及光呼吸中釋放出來的氨毒性的解毒酶。PPT能夠強(qiáng)烈抑制GS，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氨的含量的迅速積累。而氨的積累直接抑制光系統(tǒng)I和光系統(tǒng)II反應(yīng)，減少跨膜PH梯度，使光合磷酸化解耦聯(lián)，隨之葉綠體結(jié)構(gòu)解體，整個植物死亡。而PPT是目前廣泛使用的除草劑的成分，殺草譜廣，對植物的地上部分和地下部分均有枯殺作用，在土壤中易被代謝分解，殘留期短，半衰期只有2－3天