細菌內(nèi)毒素干擾實驗培訓課件

細菌內(nèi)毒素干擾實驗細菌內(nèi)毒素干擾實驗1目錄/CONTENTS0102細菌內(nèi)毒素干擾實驗相關理論和概念細菌內(nèi)毒素干擾實驗具體操作方法及注意事項目錄/CONTENTS0102細菌內(nèi)毒素干擾實驗相關理論和概2為什么要進行細菌內(nèi)毒素干擾實驗?

影響細菌內(nèi)毒素實驗的主要因素有哪些？思考？為什么要進行細菌內(nèi)毒素干擾實驗?

影響細菌內(nèi)毒素實驗的主要因3通過鱟實驗法檢供試品內(nèi)毒素含量，受到多種因素的影響，如供試品的pH值、溫度、離子強度、濃度，蛋白質(zhì)和可發(fā)生鱟試劑反應的非內(nèi)毒素雜質(zhì)等都會對內(nèi)毒素的檢測產(chǎn)生干擾。干擾實驗的目的是確定供試品在多大稀釋倍數(shù)或濃度下對內(nèi)毒素和鱟試劑的反應不存在干擾作用，為能否使用細菌內(nèi)毒素檢查法提供依據(jù)。------2010版《中國藥品檢驗標準操作規(guī)范》通過鱟實驗法檢供試品內(nèi)毒素含量，受到多種因素的影響，如供試品4LOGO當進行新藥的內(nèi)毒素檢查試驗前，或無內(nèi)毒素檢查項的品種建立內(nèi)毒素檢查法時，須進行干擾試驗。當鱟試劑、供試品的處方、生產(chǎn)工藝改變或試驗環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗結果的變化時，須重新進行干擾試驗。什么時候需進行干擾實驗？LOGO當進行新藥的內(nèi)毒素檢查試驗前，或無內(nèi)毒素檢查項的品種5干擾實驗所需要的試劑及器具？

鱟試劑細菌內(nèi)毒素檢查用水細菌內(nèi)毒素工作標準品(中國食品藥品檢定研究院)內(nèi)毒素凝膠檢測儀旋渦混合器試管架、安瓿架、鑷子、剪刀、砂輪、封口膜或醫(yī)用膠布、標記筆等注意：凡是與供試品或反應試劑接觸的器具，必須經(jīng)除熱原處理。干擾實驗所需要的試劑及器具？

鱟試劑注意：凡是與供試品或反6實驗基本流程圖供試品限值確定最大有效稀釋倍數(shù)確認供試驗品干擾實正式實驗結果確定實驗基本流程圖供試品限值確定最大有效稀釋倍數(shù)確認供試驗品干擾7藥品、生物制品的細菌內(nèi)毒素限值(L)一般按以下公式確定∶

L=K/ML為供試品的細菌內(nèi)毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U(活性單位)表示；K為人每千克體重每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量，以EU/(kg?h)表示.M為人用每千克體重每小時的最大供試品劑量，以ml/(kg?h)、mg/(kg?h)或U/(kg?h)表示。最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的確定MVD=CL/入藥品、生物制品的細菌內(nèi)毒素限值(L)一般按以下公式確定∶8基本操作方法：

按表1制備溶液A、B、C和D，使用的供試品溶液應為未檢驗出內(nèi)毒素且不超過最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)的溶液，按鱟試劑靈敏度復核試驗項下操作。基本操作方法：

按表1制備溶液A、B、C和D，使用的供試品溶9編號內(nèi)毒素濃度/被加入內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無/供試品溶液——————2B2λ/供試品溶液供試品溶液12482λ1λ0.5λ0.25λ2222C2λ/檢查用水檢查用水12482λ1λ0.5λ0.25λ2222D無/檢查用水——————2注：A為供試品溶液；B為干擾試驗系列；C為鱟試劑標示靈敏度的對照系列；D為陰性對照。編號內(nèi)毒素濃度/被加入內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素10結果判定：01020304溶液A和陰性對照溶液D的所有平行管都為陰性，并且系列溶液C的結果符合鱟試劑靈敏度復核試驗要求時，試驗方為有效。當系列溶液B的結果符合鱟試劑靈敏度復核試驗要求時，認為供試品在該濃度下無干擾作用其他情況則認為供試品在該濃度下存在干擾作用。若供試品溶液在小于MVD的稀釋倍數(shù)下對試驗有干擾，應將供試品溶液進行不超過MVD的進一步稀釋，再重復干擾試驗。結果判定：01020304溶液A和陰性對照溶液D的所有平行管11當最大濃度2λ管均為陽性，最低濃度0.25λ管均為陰性，陰性對照管為陰性，試驗方為有效。按下式計算反應終點濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測定值(λc)。λc=antilg(∑X／n)式中X為反應終點濃度的對數(shù)值(lg)。反應終點濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個呈陽性結果的濃度；n為每個濃度的平行管數(shù)。當λc在0.5～2λ(包括0.5λ和2λ)時，方可用于細菌內(nèi)毒素檢查，并以標示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。鱟試劑靈敏度復核試驗要求：當最大濃度2λ管均為陽性，最低濃度0.25λ管均為陰性，陰性12λc=antilg(∑X／n)的計算方法問題？怎么用計算器按出antilg值？antilg是lg函數(shù)的反函數(shù)，該表格未經(jīng)確認可以用power公式λc=antilg(∑X／n)的計算方法問題？怎么用計算器按13原因解決措施解決有關pH的問題用BET水對供試品在允許的范圍內(nèi)進行稀釋用酸、堿或緩沖液來調(diào)節(jié)pH二價陽離子濃度不足使用含Mg或Ca離子的稀釋劑稀釋樣品，降低活性螯合劑的含量注意過高的二價陽離子（如Ca）濃度可能會帶來抑制內(nèi)毒素聚集問題如果內(nèi)毒素標準品溶液需要儲存，必須驗證其儲存條件是否會影響其活性經(jīng)常旋渦混合含有標準內(nèi)毒素的溶液酶、酶抑制劑問題使用BET水稀釋10倍，然后使用75℃加熱10分鐘異常結果的處理及常見的消除干擾的方法原因解決措施解決有關pH的問題用BET水對供試品在允許的范圍14舉個列子Mg離子是鱟試劑重要的輔因子，沒有Mg離子，內(nèi)毒素將無法激活鱟試劑的酶。常見的螯合劑如：EDTA、檸檬酸鈉、肝素鈉、喹諾酮類等。供試品中的螯合劑成分會螯合試劑中的二價陽離子（如Mg2+離子），造成抑制。消除干擾的一個重要原則是不能影響供試品中的內(nèi)毒素活性！要使用預先添加了標準內(nèi)毒素再經(jīng)過處理的供試品溶液進行干擾試驗。舉個列子Mg離子是鱟試劑重要的輔因子，沒有Mg離子，內(nèi)毒素15談一談現(xiàn)象：我司內(nèi)毒素檢測時一般會使用的酸或堿調(diào)節(jié)PH。且在操作過程中會先調(diào)節(jié)PH，后加入標準內(nèi)毒素。已知強酸強堿會破壞內(nèi)毒素成分。討論該操作是否會造成假陰性結果的出現(xiàn)。操作過程中是否也應該預先添加了標準內(nèi)毒素再處理供試品溶液是否需要做內(nèi)毒素的回收實驗談一談現(xiàn)象：我司內(nèi)毒素檢測時一般會使用的酸或堿調(diào)節(jié)PH。且在16個人經(jīng)驗總結及實驗操作注意事項：1.在介于未稀釋的原液到MVD之間選擇若干濃度時，當MVD不大時，建議選擇2倍梯度稀釋；當MVD較大時，選擇10倍梯度稀釋。2.不要選擇第一個無干擾的稀釋濃度，其干擾狀態(tài)可能處于臨界值。3.凝膠法干擾初實驗中。可以選擇任意靈敏度鱟試劑，一般為了實驗方便，選擇低靈敏度的鱟試劑。4.細菌內(nèi)毒素標準品的開啟只能在安瓿的易折點上部開啟內(nèi)毒素，不能沿易折點開啟，防止振蕩過程中內(nèi)毒素溶液與封口膜接觸，污染標準品溶液。5.稀釋后的細菌內(nèi)毒素溶液靜置時間超過10分鐘，再用前在旋渦混合器上振搖1分鐘，放置4小時以上的內(nèi)毒素溶液應丟棄。個人經(jīng)驗總結及實驗操作注意事項：1.在介于未稀釋的原液到MV17思考1.干擾試驗是否要選擇合適的樣品或合適的TAL靈敏度？2.干擾試驗中內(nèi)毒素回收試驗是否都必須做？思考1.干擾試驗是否要選擇合適的樣品或合適的TAL靈敏度？181.干擾試驗是否要選擇合適的樣品或合適的TAL靈敏度？

是的。具備一定條件的樣品才適合做干擾試驗，而樣品是否合適，在一定程度上又與所選TAL的靈敏度密切相關。

“合適”的樣品是指樣品必須不含有可測出的細菌內(nèi)毒素。具體的講就是在干擾試驗（或干擾試驗的預試驗）中用樣品（或樣品的稀釋液）所做的陰性管（NPC管）不能凝，如凝說明本批樣品不適合用來做干擾試驗。有部分實驗者認為只要用家兔熱原檢查結果陰性的樣品就可用于干擾試驗。這不可靠，因為家兔法不如細菌內(nèi)毒素檢查法靈敏，不能保證在干擾試驗（或干擾試驗的預試驗）中樣品的細菌內(nèi)毒素不被檢出。

“合適”的TAL靈敏度，是指做干擾試驗時所選的TAL靈敏度不能太靈敏，以免得出樣品不適合做干擾試驗的結論，這是一個實驗技巧的問題。另有些實驗者認為在正式做干擾試驗時，選擇TAL的靈敏度（λ）值必須與樣品的稀釋倍數(shù)（D）有一定的對應關系（如按公式λ=L/D），這是誤解。其實，除了要考慮使樣品的細菌內(nèi)毒素不被檢出外，別無理由規(guī)定要選什么樣的TAL靈敏度去做干擾試驗。1.干擾試驗是否要選擇合適的樣品或合適的TAL靈敏度？192.干擾試驗中內(nèi)毒素回收試驗是否都必須做？

不一定?；厥赵囼灥哪康氖菫榱丝疾煜蓴_的方法是否會造成樣品中原有內(nèi)毒素檢出的增加或減少。因此，對于采用“過濾法”、“沉淀法”、“酸堿調(diào)節(jié)法”及其他有可能造成樣品中原有內(nèi)毒素檢出的增加或減少的方法，理