血紅蛋白的提取和分離課件

課題3血紅蛋白的提取和分離主要內容：一、基礎知識二、實驗操作精選課件1課題3血紅蛋白的提取和分離主要內容：精選課件1一、基礎知識---蛋白質分離和提取的原理㈠凝膠色譜法（分配色譜法）1、凝膠：一些微小多孔的球體（內含許多貫穿的通道，由多糖類構成如葡聚糖、瓊脂糖）2、概念：根據(jù)相對分子質量的大小分離蛋白質的有效方法3、原理：精選課件2一、基礎知識---蛋白質分離和提取的原理㈠凝膠色譜法（分4、具體過程一、基礎知識---蛋白質分離和提取的原理精選課件34、具體過程一、基礎知識---蛋白質分離和提取的原理精選課件精選課件4精選課件4分子量大小直徑大小大于凝膠顆?？障吨睆?，被阻擋在顆粒的外面小于凝膠顆粒空隙直徑，可以進入顆粒內部運動方式垂直向下移動垂直向下移動，無規(guī)則擴散進入顆粒內部運動速度較快較慢運動路徑較短較長洗脫次序先從凝膠柱洗脫出來后從凝膠柱洗脫出來一、基礎知識---蛋白質分離和提取的原理精選課件5分子量大小直徑大小大于凝膠顆?？障吨睆?，被阻擋在顆粒的外面小用凝膠色譜法分離蛋白質時，分子量大的蛋白質A．路程較長，移動速度較慢B．路程較長，移動速度較快C．路程較短，移動速度較慢D．路程較短，移動速度較快D精選課件6用凝膠色譜法分離蛋白質時，分子量大的蛋白質D精選課件6相對分子質量不同的蛋白質在凝膠中的進行過程可表示為圖中哪一個B精選課件7相對分子質量不同的蛋白質在凝膠中的進行過程可表示為圖中哪一個1、概念：在一定的范圍內，能對抗外來少量強酸、強堿或稍加稀釋不引起溶液PH發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。㈡緩沖溶液：2、作用：能夠抵制（）對溶液（）的影響，維持PH基本不變。外界的酸或堿pH值精選課件81、概念：在一定的范圍內，能對抗外來少量強酸、強堿或稍加稀釋3、緩沖溶液的配制通常由（）種緩沖劑溶解于水中配制而成。調節(jié)緩沖劑的（）就可以制得（）使用的緩沖液。1－2使用比例在不同PH范圍內思考：說出人體血液中緩沖液。NaH2PO4/Na2HPO4H2CO3/NaHCO3磷酸緩沖液，保證血紅蛋白的正常結構和功能，便于觀察(紅色)和科學研究其(活性)4、在本課題中使用的緩沖液？精選課件93、緩沖溶液的配制通常由（）種緩沖劑溶解于水（三）電泳：1.概念：帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程。2.原理：

①許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團，在一定的PH下，這些基團會帶上正電或負電。②在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。③電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質的差異以及分子本身的大小，形狀的不同，使帶電分子產生不同的遷移速度，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。3.類型:瓊脂糖凝膠電泳、聚丙稀酰胺凝膠電泳。精選課件10（三）電泳：1.概念：帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動瓊脂糖凝膠電泳示意圖精選課件11在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動4、聚丙稀酰胺凝膠電泳（1）聚丙稀酰胺凝膠：是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N，—亞甲基雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成的具有三維網(wǎng)狀結構的凝膠。蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素。為了消除凈電荷對遷移率的影響，可以在凝膠中加入SDS。（2）原理：精選課件124、聚丙稀酰胺凝膠電泳（1）聚丙稀酰胺凝膠：是由單體丙烯酰SDS能使蛋白質發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質復合體在SDS的作用下會解聚成單條肽鏈，因此測定的結果只是單條肽鏈的分子量。SDS能與各種蛋白質形成蛋白質—SDS復合物，SDS所帶負電荷的量大大超過了蛋白質分子原有電荷量。因而掩蓋了不同種蛋白質間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。（3）SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳作用機理:4、聚丙稀酰胺凝膠電泳精選課件13SDS能使蛋白質發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質復合體在使用SDS-聚丙烯酰胺電泳過程中，不同蛋白質的電泳遷移率完全取決于A電荷的多少B分子的大小C肽鏈的多少D分子形狀的差異精選課件14使用SDS-聚丙烯酰胺電泳過程中，不同蛋白質的電泳遷移率完全

蛋白質的提取和分離一般分為四步：（1）樣品處理：包括洗滌紅細胞；血紅蛋白稀釋；離心等操作收集到的血紅蛋白溶液。（2）粗分離：透析除去分子較小的雜質。（3）純化：通過凝膠色譜法將分子量較大的雜質蛋白質除去。（4）純度鑒定：通過聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。二、實驗操作：樣品處理→粗分離→純化→純度鑒定精選課件15

蛋白質的提取和分離一般分為四步：二、實驗操作：樣品處理→粗血液血漿水分其他物質：血漿蛋白、無機鹽、磷脂、葡萄糖等血細胞白細胞血小板紅細胞（最多）血紅蛋白（90％）兩個α－肽鏈兩個β一肽鏈四個亞鐵紅素基團1.血液有哪些成分？2.你認為鳥類血液和哺乳動物血液中，最好哪種血液來提取血紅蛋白？為什么？二、實驗操作：樣品處理→粗分離→純化→純度鑒定知識回顧精選課件16血液血漿水分其他物質：血漿蛋白、無機鹽、磷脂、葡萄糖等血細（一）樣品處理1、紅細胞的洗滌：2、血紅蛋白的釋放：3、分離血紅蛋白溶液：4、透析：（如何除無機鹽離子和小分子有機物質呢？）

血液＋檸檬酸鈉→低速短時離心→吸出上層血漿→紅細胞＋5倍體積生理鹽水→緩慢攪拌10min→低速短時離心→吸出上清液→反復洗滌直至上清液無黃色在蒸餾水和甲苯（？）作用下，紅細胞破裂釋放紅細胞破碎混合液→中速長時離心（2000c/min×10min）→濾紙過濾除去脂質→分液漏斗分離出血紅蛋白，得到紅色透明液體。裝入透析袋并置于磷酸緩沖液中（PH為7.0）透析。二、實驗操作：樣品處理→粗分離→純化→純度鑒定精選課件17（一）樣品處理1、紅細胞的洗滌：血液＋檸檬酸鈉→低速短時離心分離血紅蛋白溶液有機溶劑無色透明的甲苯層脂類物質白色脂溶性物質沉淀層血紅蛋白溶液紅色透明液體紅細胞破碎物沉淀暗紅色沉淀物精選課件18分離血紅蛋白溶液有機溶劑無色透明的甲苯層脂類物質透析過程動畫演示精選課件19透析過程動畫演示精選課件19練習鞏固1、隨著人類跨入蛋白質組時代，對蛋白質的研究和應用越來越深入，首先要做的一步是A弄清各種蛋白質的空間結構B弄清各種蛋白質的功能C弄清各種蛋白質的合成過程D獲得高純度的蛋白質精選課件20練習鞏固1、隨著人類跨入蛋白質組時代，對蛋白質的研究和應用越2、用凝膠色譜法分離蛋白質的過程中，關于蛋白質的敘述，正確的是A相對分子質量較小的蛋白質行程大于相對分子質量較大的蛋白質B相對分子質量較小的蛋白質行程小于相對分子質量較大的蛋白質C相對分子質量較小的蛋白質行程等于相對分子質量較大的蛋白質D二者根本無法比較精選課件212、用凝膠色譜法分離蛋白質的過程中，關于蛋白質的敘述，正確的3、使用SDS-聚丙烯酰胺電泳過程中，不同蛋白質的電泳遷移率完全取決于A電荷的多少B分子的大小C肽鏈的多少D分子形狀的差異4、在采血容器中加入檸檬酸鈉的目的是A調節(jié)pHB維持紅細胞的能量供應C防止微生物生長D防止血液凝固精選課件223、使用SDS-聚丙烯酰胺電泳過程中，不同蛋白質的電泳遷移率5、一分子血紅蛋白最多可攜帶的O2分子數(shù)和CO2分子數(shù)分別是A4、2B4、4C2、1D、1、16、記住樣品處理中的血紅蛋白溶液離心后分層順序自上而下是：有機溶劑-----脂類物質-----血紅蛋白溶液------紅細胞破碎物沉淀精選課件235、一分子血紅蛋白最多可攜帶的O2分子數(shù)和CO2分子數(shù)分別（二）凝膠色譜操作---純化1、凝膠色譜柱的制作：二、實驗操作：樣品處理→粗分離→純化→純度鑒定色譜柱的制作過程：準備材料→加工橡皮塞→安裝色譜柱精選課件24（二）凝膠色譜操作---純化1、凝膠色譜柱的制作：二、實驗操2、凝膠色譜柱的裝填步驟操作要求①操作要求色譜柱垂直固定在支架上②計算稱量凝膠根據(jù)色譜柱體積計算凝膠用量③配制懸浮液凝膠顆粒＋蒸餾水→充分溶脹凝膠顆粒＋洗脫液→沸水浴④裝填懸浮液一次性緩慢倒入；輕輕敲打⑤緩沖液洗滌平衡立刻用磷酸緩沖液洗滌平衡12h精選課件252、凝膠色譜柱的裝填步驟操作要求①操作要求色譜柱垂直固定在支裝配好的凝膠柱精選課件26裝配好的凝膠柱精選課件263、樣品加入與洗脫---調節(jié)緩沖液面→加入蛋白質樣品→調節(jié)緩沖液面→洗脫→收集分裝蛋白質（1）調節(jié)緩沖液面：打開下端出口，使柱內緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關閉出口。（2）滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，同時注意不要破壞凝膠面。（3）樣品滲入凝膠床：加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內，等樣品完全進入凝膠層后，關閉下端出口。（4）洗脫：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進行洗脫。（5）收集：待紅色的蛋白質接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集。（在分離過程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動，說明色譜柱制作成功）（6）注意：正確的加樣操作：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。精選課件273、樣品加入與洗脫---調節(jié)緩沖液面→加入蛋白質樣品→調節(jié)緩注意：正確的加樣操作是（1）不要觸及并破壞凝膠面。（2）貼壁加樣。（3）使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。3、樣品加入與洗脫---調節(jié)緩沖液面→加入蛋白質樣品→調節(jié)緩沖液面→洗脫→收集分裝蛋白質精選課件28注意：正確的加樣操作是（1）不要觸及并破壞凝膠面。（2）貼壁思考下面的問題：讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的pH范圍內，維持結構和功能。

1、在血紅蛋白的整個過程中不斷用磷酸緩沖液處理的目的是什么？

2、與其他真核細胞相比，紅細胞有什么特點？這一特點對你進行蛋白質得分離有什么意義？

血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時可以通過觀察顏色來判斷什么時候應該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實驗操作。3、你能描述血紅蛋白分離的完整過程嗎？

血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。首先通過洗滌紅細胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即:樣品的處理；再經(jīng)過透析去除分子量較小的雜質，即樣品的粗分離；然后通過凝膠色譜法將相對分子質量較大的雜質蛋白除去，即:樣品的純化；最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純度鑒定。精選課件29思考下面的問題：讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的pH范圍內，維持結構和功收集得到的純化后的蛋白精選課件30收集得到的純化后的蛋白精選課件30在裝填凝膠柱時，不能有氣泡存在的原因是A、氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質的洗脫次序，降低分離效果B、氣泡阻礙蛋白質的運動C、氣泡與蛋白質發(fā)生化學反應D、氣泡在裝填凝膠的時候，使凝膠不緊密A精選課件31在裝填凝膠柱時，不能有氣泡存在的原因是A精選課件31樣品的加入和洗脫的操作不正確的是A．加樣前，打開色譜柱下端的流出口，使柱內凝膠面上的緩沖液緩慢下降到凝膠面的下面B．加樣后，打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內C．等樣品完全進入凝膠層后，關閉下端出口D．用吸管小心的將1ml透析后的樣品加到色譜柱的頂端，不要破壞凝膠面

A

精選課件32樣品的加入和洗脫的操作不正確的是下列是有關血紅蛋白提取和分離的相關操作，其中正確的是（）A．可采集豬血作為實驗材料B．用蒸餾水重復洗滌紅細胞C．血紅蛋白釋放后應低速短時間離心D．洗脫液接近色譜柱底端時開始收集流出液

A精選課件33下列是有關血紅蛋白提取和分離的相關操作，其中正確的是（三、SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白純度。目的：血紅蛋白的取和分離凝膠色譜法原理分離過程凝膠電泳法緩沖溶液組成作用蛋白質的提取分離樣品處理粗分離純化純度鑒定血紅蛋白的提取和離蛋白質分子的差異性蛋白質分子的差異性凝膠色譜法原理分離過程凝膠電泳法凝膠色譜法原理分離過程凝膠電泳法緩沖溶液組成作用緩沖溶液組成作用蛋白質的提取分離樣品處理粗分離純化純度鑒定蛋白質的提取分離樣品處理粗分離純化純度鑒定精選課件34三、SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白純度。目的：血紅蛋

觀察你處理的血液樣品離心后是否分層（見教科書圖5-18），如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時間過長，會使白細胞和淋巴細胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。四、實驗結果分析與評價

1、你是否完成了對血液樣品的處理？你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？2、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產生？你的色譜柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？

由于凝膠是一種半透明的介質，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質，例如藍色葡聚糖—2000或紅色葡聚糖，觀察色帶移動的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時要重新裝柱。

精選課件35觀察你處理的血液樣品離心后是否分層（見教科書圖5-1

如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關。3、你能觀察到蛋白質的分離過程中，紅色區(qū)帶的移動嗎？請描述紅色區(qū)帶的移動情況，并據(jù)此判斷分離效果？四、實驗結果分析與評價本課題作業(yè);1.凝膠色譜法分離蛋白質的的原理是怎樣的?2.什么是緩沖溶液?它的作用是什么?3.電泳的作用及其原理是什么?4.你能描述血紅蛋白分離的完整過程嗎?5.與其他真核細胞相比,紅細胞有什么特點?這