編制說明-普通絲瓜雜交種純度鑒定SSR法技術(shù)規(guī)程

湖南省地方標準《普通絲瓜雜交種純度鑒定SSR法技術(shù)規(guī)程》編制說明一、任務(wù)來源根據(jù)湖南省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局下發(fā)的關(guān)于下達2022年度第1批地方標準制修訂項目計劃的通知，對湖南省地方標準《普通絲瓜雜交種純度鑒定SSR法技術(shù)規(guī)程》進行制定。本標準的主要起草單位為湖南省蔬菜研究所，由湖南省農(nóng)業(yè)標準化技術(shù)委員會歸口。二、制定目的、意義絲瓜系葫蘆科絲瓜屬一年生攀緣性草本植物，是長沙市人民喜食的瓜類蔬菜，也是常見的藥食同源植物（Partapetal,2012），不僅具有較高的營養(yǎng)價值，還具有清熱化痰、涼血解毒等醫(yī)療保健作用和消除雀斑、美白去皺的美容價值（邵興云等，2004；單承鶯等，2016）。我國栽培的絲瓜主要有普通絲瓜【Luffacylindrica(L.)Roem．】和有棱絲瓜【Luffaacutangula(L.)Roxb.】兩個栽培種，原產(chǎn)于印度，主要分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)（Baletal,2004）。其中，普通肉絲瓜在湖南省近年來種植面積逐年擴大，據(jù)省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳調(diào)查統(tǒng)計，2022年全省絲瓜播種面積達47萬畝，對于保障我國絲瓜市場供應(yīng)起了重要作用。絲瓜雜交種純度鑒定主要采用形態(tài)學鑒定、生化鑒定及分子標記鑒定3種方法。其中，應(yīng)用最廣的是形態(tài)學鑒定，即主要根據(jù)種子、子房形狀等形態(tài)學特征進行鑒定，該方法實用性強，但存在周期長、占地面積大等缺陷。生化鑒定由于可利用的生化標記多態(tài)性差，電泳譜帶分辨率低，嚴重限制了其應(yīng)用范圍。相較于形態(tài)學鑒定和生化鑒定，分子標記鑒定具穩(wěn)定性好、信息量大等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物和蔬菜種子純度質(zhì)量檢測。其中SSR標記由于具有數(shù)量豐富、多態(tài)性高、穩(wěn)定性好、操作簡便及結(jié)果準確性高等優(yōu)點，已成為分子生物學研究的首選分子標記之一，廣泛應(yīng)用于大豆、水稻、玉米、油菜等農(nóng)作物的種子純度鑒定，在玉米、水稻品種真實性和純度鑒定中，已經(jīng)作為標準技術(shù)體系納入到國家或地方行業(yè)標準。絲瓜雜交種純度鑒定的SSR法一直以現(xiàn)行的其它物種的國家標準為依據(jù)，造成鑒定時間、成本的浪費，不能滿足快速鑒定絲瓜雜交種純度的需求。為規(guī)范市場、保護種業(yè)公司和種植者權(quán)益，提升絲瓜雜交種的質(zhì)量和市場競爭力，為絲瓜種子的生產(chǎn)、加工、銷售和行業(yè)管理部門提供科學依據(jù)，研究、制定規(guī)范絲瓜雜交種純度鑒定的技術(shù)標準十分必要、意義重大。三、制定標準的原則1.合規(guī)的原則本文件充分遵照國內(nèi)相關(guān)法律法規(guī)，并按照GB/T1.1-2020《標準化工作導(dǎo)則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。2.安全的原則制定本文件遵循確保質(zhì)量安全的原則，標準中有關(guān)質(zhì)量安全控制必須符合GB/T3543.1《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程》和《GB16715.1瓜菜作物種子，瓜類》中質(zhì)量要求。3.科學的原則制定本文件需要從內(nèi)在規(guī)律出發(fā)，充分掌握普通絲瓜的SSR分子標記特性、生長特征特性及植物DNA擴增檢測的方法，標準主要內(nèi)容和各項指標力求科學合理。4.可操作的原則本文件所確定的普通絲瓜雜交種純度鑒定SSR法技術(shù)的各項要求力求準確，有較強的操作性。五、標準制定的過程1.前期準備工作2022年3月開始啟動標準制訂工作，3月上旬召開地方標準起草啟動會，確定本文件制定由湖南省蔬菜研究所起草，成立編制組，制定了工作計劃，起草人員由韓小霞、胡新軍、閔子揚、李勇奇等組成，確定了人員分工，確定了標準制定的方法與思路，明確了各階段的任務(wù)與目標。2.開展調(diào)查研究及初試2022年4月-2023年6月月，編制組成員收集與起草標準有關(guān)的資料，查閱了國家和省內(nèi)的法律、法規(guī)，國內(nèi)外的標準文本，湖南省相關(guān)的發(fā)展規(guī)劃與政策性文件等。期間多次赴湖南湘研種業(yè)有限公司、湖南興蔬種業(yè)有限公司、湖南湘妹子種業(yè)有限公司等大型瓜類蔬菜種子生產(chǎn)基地進行實地考察，了解我省瓜類蔬菜雜交種制種、純度鑒定技術(shù)應(yīng)用現(xiàn)狀及進展，為文件起草打下了充分的基礎(chǔ)。3.標準的征求意見稿2022年6月-7月，編制組成員將收集到的與標準起草有關(guān)的資料和交流意見進行整理，完成了標準文本的撰寫，形成標準征求意見稿，同時撰寫了編制說明。4.征求意見2023年6月-7月，編制組進行了網(wǎng)上和函件標準意見征求。征求了湖南農(nóng)業(yè)大學、衡陽市蔬菜研究所、長沙市農(nóng)業(yè)科學研究院、等單位或部門的意見，并征求了6位專家的意見，共征集意見條，見附表1。5.編制標準送審稿2023年8月，編制組將收集到的反饋意見，經(jīng)過分析、整理，對標準的內(nèi)容進行了逐項修改和完善，形成了標準送審稿。6.標準審查會2023年8月日，湖南省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳組織有關(guān)專家在長沙對湖南省蔬菜研究所編制的《普通絲瓜雜交種純度鑒定SSR法技術(shù)規(guī)程》（送審稿）進行了審查。專家組聽取了標準起草單位的編制說明，對標準文本內(nèi)容逐條逐款地進行了質(zhì)詢，專家組一致同意該標準通過審查，并建議標準起草組根據(jù)專家組的意見（見審查會議紀要）對該標準進行修改完善后報湖南省農(nóng)業(yè)標準化技術(shù)委員會批準發(fā)布。7.標準報批稿根據(jù)評審專家的意見，標準編制組對標準文本進行了修改和完善，形成了標準報批稿。五、制定標準的依據(jù)在編制該項標準的過程中，我們依據(jù)的標準有GB/T3543.1《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程》和GB16715.1《瓜菜作物種子，瓜類》。六、標準的主要內(nèi)容說明1.標準的適用范圍本文件適用于普通絲瓜雜交種純度鑒定。2.標準的主要內(nèi)容（1）本文件規(guī)定了普通絲瓜雜交種純度鑒定術(shù)語和定義、鑒定原理和流程等要求。（2）本文件根據(jù)按照GB/T1.1-2020《標準化工作導(dǎo)則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。（3）根據(jù)目前雜交種純度鑒定成功經(jīng)驗和做法，本文件從絲瓜種子發(fā)芽、DNA提取、PCR反應(yīng)、電泳檢測、結(jié)果統(tǒng)計與計算等流程上規(guī)范了普通絲瓜雜交種純度鑒定SSR法的具體操作流程。種子發(fā)芽的章節(jié)，針對不同類型絲瓜品種選擇浸種方法，并對催芽過程中遇到的長菌斑問題指導(dǎo)處理；DNA提取章節(jié)，提供了兩種DNA提取方法，對于需要長期保存的樣品DNA采用常規(guī)CTAB法，對于現(xiàn)提現(xiàn)用樣品采用快速堿煮法；PCR反應(yīng)章節(jié)，通過摸索不同試劑配比，提出節(jié)約成本的10μl反應(yīng)體系，為節(jié)約時間，減少PCR擴增的循環(huán)數(shù)；電泳檢測章節(jié)，介紹了2種檢測方法，對于擴增條帶大小差別不大的擴增產(chǎn)物采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，擴增條帶大小差別較大的擴增產(chǎn)物建議采用普通瓊脂糖凝膠電泳。對變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法和操作步驟進行簡化，與快速堿煮法相結(jié)合節(jié)約了試驗成本和鑒定時間，大大提高了鑒定效率。七、標準結(jié)構(gòu)框架本文件文本包括的主要章節(jié)內(nèi)容如下：前?言1范圍 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 4原理5主要儀器設(shè)備和試劑耗材6試劑配制7引物8鑒定流程9純度計算附錄A（資料性）常用試劑配方附錄B（資料性）引物信息八、標準預(yù)計產(chǎn)生的經(jīng)濟、社會效益本標準利用SSR分子標記法對普通絲瓜雜交種純度進行鑒定，與傳統(tǒng)的田間形態(tài)學鑒定相比，該鑒定方式克服了田間鑒定成本高、周期長、鑒定結(jié)果受經(jīng)驗和環(huán)境影響較大的缺陷，具有簡單、快速、省時省工、準確率高、重復(fù)性好的優(yōu)勢。根據(jù)該技術(shù)規(guī)程，科學合理使用鑒定方式，以篩選純度合格的雜交種為關(guān)鍵，保障了絲瓜種子的質(zhì)量安全，具有較高的經(jīng)濟效益。該鑒定方法還可有效減少農(nóng)田使用，簡接減少農(nóng)藥用量和農(nóng)藥殘留，有利于提升品牌競爭力。同時，通過減少農(nóng)田土壤污染，使農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境得到保護，可有力推動綠色生態(tài)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展，社會效益和生態(tài)效益顯著。附表1湖南省地方標準修改單征求意見處理匯總表標準編號標準名