基因組文庫、cDNA文庫的構(gòu)建和篩選課件

基因組文庫、cDNA文庫的構(gòu)建和篩選基因組文庫、cDNA文庫的構(gòu)建和篩選基因文庫—是來自于某種生物的不同

DNA序列的集合基因組文庫—用于構(gòu)建文庫的DNA來源于基因組DNAcDNA—用于構(gòu)建文庫的DNA是mRNA群體的拷貝（cDNA），則該文庫稱之為cDNA文庫。cDNA文庫不包括不能轉(zhuǎn)錄的核基因序列具有代表性的基因文庫應(yīng)該在最大限度上覆蓋所有的原初序列。基因文庫—是來自于某種生物的不同

DNA序列的集合基因組文庫文庫大小以最大可能可獲得某一特定序列的基因文庫所必須包含的重組體數(shù)的計(jì)算方式如下：

N＝ln(1-p)/ln(1-f)P—給定的概率，f—插入片段大小占總基因組大小的比例如果給定概率為0.99，插入片段為20kb的情況下，對人類基因組（3*109bp）來說，所需重組體的數(shù)目為6.9*105；而對于大腸桿菌而言，僅需要1100個(gè)重組體。文庫大小以最大可能可獲得某一特定序列的基因文庫所必須包含的重因此，插入大小僅有5－10kp的質(zhì)粒就可以很好地構(gòu)建原核生物的基因組文庫，因?yàn)橹恍枰獛浊€(gè)重組體就夠了。而對于較大的基因組，較大的插入片段可以使所需的重組體數(shù)量減少，這也正是開發(fā)黏粒以及YAC載體的原因。因此，插入大小僅有5－10kp的質(zhì)粒就可以很好地構(gòu)建原核生物基因組DNA為了構(gòu)建具有代表性的基因文庫，必須將純化后的基因組DNA進(jìn)行隨機(jī)切割，產(chǎn)生適合克隆進(jìn)所用載體的大小合適的片段真核生物基因組DNA的提取提取細(xì)胞核—為了防止器官（葉綠體、線粒體）DNA的污染蛋白酶降解及分相抽提—去除蛋白質(zhì)、脂類以及其他的大分子雜質(zhì)原核細(xì)胞基因組DNA的提取直接抽提DNA基因組DNA為了構(gòu)建具有代表性的基因文庫，必須將純化后的基經(jīng)提取的基因組DNA是由染色體斷裂而成的數(shù)百kb大小的長片段構(gòu)成長片段的進(jìn)一步切割。純化的基因組DNA需要用物理剪切或限制性酶解切割成載體適用的片段（15~25Kb或更大）。

經(jīng)提取的基因組DNA是由染色體斷裂而成的數(shù)百kb大小的長片段

物理剪切—利用振蕩、超聲等物理方法剪切可以非常隨機(jī)地進(jìn)一步將長片段切割成小片段，片段末端通常都是平末端限制性酶解—位點(diǎn)非隨機(jī)分布。常用的酶是Sau3A，該酶產(chǎn)生的酶切黏性末端與BamHI酶解載體產(chǎn)生的末端相同物理剪切—利用振蕩、超聲等物理方法剪切可以非常隨機(jī)地進(jìn)基因組DNA片段的限制性內(nèi)切酶酶解使用限制性內(nèi)切酶酶解基因組DNA可產(chǎn)生非隨機(jī)片段，為了獲得15－25kb的或更大的基因組DNA片段（適用于λ噬菌體或黏粒載體的片段），需要進(jìn)行部分酶解，即通過合理使用限制性內(nèi)切酶（種類和用量），調(diào)節(jié)酶切片段的大小合適的酶切片段可由瓊脂糖凝膠電泳或蔗糖梯度純化回收基因組DNA片段的限制性內(nèi)切酶酶解使用限制性內(nèi)切酶酶解基因組基因組DNA文庫的構(gòu)建流程提取切割整合轉(zhuǎn)化基因組DNA文庫的構(gòu)建流程提取質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體藍(lán)白篩選藍(lán)白篩選YAC載體YAC載體基因組文庫、cDNA文庫的構(gòu)建和篩選課件置換型載體允許外源DNA片段替換非必須DNA片段的載體，稱為置換型載體（replacementvectors）。一般情況下，置換型載體克隆外源片段的大小范圍是9-23kb，故而該載體主要用來構(gòu)建基因組文庫。如λ置換載體（EMBL3等）

置換型載體允許外源DNA片段替換非必須DNA片段的載EMBL3：載體大小為43kb，其左臂、右臂和填充片段的大小分別為20kb、9kb和14kb。從提高克隆效率角度來看，它們克隆DNA片段的大小為9-23kb。在填充片段中帶有

red和

gam基因，當(dāng)外源片段替換填充片段后，重組體將變成

red-gam-，同時(shí)載體上含有

chiC位點(diǎn)，因此可用P2噬菌體的溶源性大腸桿菌進(jìn)行Spi篩選重組體。在填充片段兩端帶有對稱的多克隆位點(diǎn)。EMBL3：載體大小為43kb，其左臂、右臂和填充片段載體質(zhì)粒載體—用于基因組較小的生物，如大腸桿菌，用質(zhì)粒載體來構(gòu)建基因組文庫，只需5000個(gè)克隆就可以達(dá)到高于99％的覆蓋率構(gòu)建較大的基因組文庫*λ噬菌體—最大可插入片段，23kb

黏?！?5kb

細(xì)菌人工染色體（BAC）—350kb

酵母人工染色體(YAC)—1000kb20060427載體質(zhì)粒載體—用于基因組較小的生物，如大腸桿菌，用質(zhì)粒載體來cDNA文庫mRNA分離、純化與分離cDNA的合成cDNA末端的處理與載體的連接cDNA文庫mRNA分離、純化與分離mRNA分離、純化與分離通常用于構(gòu)建cDNA的是真核細(xì)胞的mRNA由于cDNA從mRNA合成而來，代表了基因組的可轉(zhuǎn)錄部分，不含內(nèi)含子序列，因此可被用于在大腸桿菌中表達(dá)編碼蛋白由于每類細(xì)胞和組織只表達(dá)一套特定的基因，因此從特定組織中制備的mRNA通常會(huì)富集某些特異序列。所以有一個(gè)起始材料的選擇問題。mRNA分離、純化與分離通常用于構(gòu)建cDNA的是真核細(xì)胞的mmRNA的提取全長mRNA具有一個(gè)polyA的3’末端，可以被用于mRNA的分離；可以用寡聚纖維素柱，選擇性地吸附mRNA純化mRNA的提取全長mRNA具有一個(gè)polyA的3’末端，可以用結(jié)合有寡聚（dT）的磁珠加到細(xì)胞裂解液，在用強(qiáng)磁鐵吸出磁珠并洗出mRNA。用結(jié)合有寡聚（dT）的磁珠加到細(xì)胞裂解液，在用強(qiáng)磁鐵吸出磁檢測mRNA翻譯，檢測翻譯產(chǎn)物：用無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)（如麥胚抽提液或兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液）來檢測mRNA的完整性，也可用凝膠電泳直接檢測，用雜交法分離mRNA。檢測mRNA翻譯，檢測翻譯產(chǎn)物：示差篩選（DifferentialScreening）示差篩選（DifferentialScreening）扣除文庫(subtractivelibrary)扣除雜交又叫扣除cDNA克隆(subtractivecDNAcloning)，它是通過構(gòu)建扣除文庫(subtractivelibrary)得以實(shí)現(xiàn)的。差別雜交對于因特殊處理而被誘發(fā)產(chǎn)生的mRNA之cDNA克隆的分離，或是在細(xì)胞中具高表達(dá)效率的mRNA之cDNA克隆的分離，無疑是一種有效的方法，但對于低豐度的mRNA之cDNA克隆的分離則有相當(dāng)?shù)睦щy。為了進(jìn)一步提高差別雜交的篩選效率，一種切實(shí)可行的辦法是構(gòu)建富含目的基因序列的cDNA文庫。應(yīng)用扣除雜交篩選法便可達(dá)到此種目的。

扣除文庫(subtractivelibrary)扣除雜交又扣除雜交（SubtractiveHybridization）

扣除雜交（SubtractiveHybridization扣除雜交法已成功構(gòu)建了非洲爪蟾原腸期，鼠T淋巴細(xì)胞及大鼠前腦等特異性cDNA文庫?？鄢s交法已成功構(gòu)建了非洲爪蟾原腸期，鼠T淋巴細(xì)胞及大鼠前腦cDNA的合成用反轉(zhuǎn)錄酶通過向引物（一般為寡聚dT）的3’

末端添加dNTP來合成cDNA的第一條鏈。用末端轉(zhuǎn)移酶對cDNA的第一條鏈的3’末端加尾很容易合成全長的第二鏈。也可用反轉(zhuǎn)錄酶或Klenow酶延伸引物來合成第二鏈。

cDNA的合成用反轉(zhuǎn)錄酶通過向引物（一般為寡聚dT）的3’基因組文庫、cDNA文庫的構(gòu)建和篩選課件基因組文庫、cDNA文庫的構(gòu)建和篩選課件基因組文庫、cDNA文庫的構(gòu)建和篩選課件cDNA末端的處理由于大片段的平末端連接效率非常低，因此為了避免用平末端與載體連接，對雙鏈cDNA的末端進(jìn)行加工是十分必要的方法：添加特異性核酸接頭以形成適合于克隆的黏性末端cDNA末端的處理由于大片段的平末端連接效率非常低，因此為了cDNA末端的處理先用單鏈特異性核酸酶切掉凸出的3/端，再用Klenow酶補(bǔ)平后加上接頭。為避免限制性內(nèi)切核酸酶切割cDNA內(nèi)部，在添加接頭前先用EcoRⅠ甲基化酶甲基化。最后用T4DNA連接酶連接。cDNA末端的處理先用單鏈特異性核酸酶切掉凸出的3/端，再cDNA末端的處理末端轉(zhuǎn)移酶—可以向cDNA末端加上與克隆載體末端互補(bǔ)的尾部cDNA末端的處理末端轉(zhuǎn)移酶—可以向cDNA末端加上與克隆載末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶與載體的連接載體先用堿性磷酸酶去磷酸化以防止載體自連接。T4DNA連接酶連接載體與cDNA。噬菌體λgt11是構(gòu)建表達(dá)文庫的最適載體與載體的連接載體先用堿性磷酸酶去磷酸化以防止載體自連接。質(zhì)粒載體：cDNA相對較短。噬菌體載體：構(gòu)建表達(dá)cDNA文庫質(zhì)粒載體：cDNA相對較短。與載體的連接與載體的連接基因組文庫、cDNA文庫的構(gòu)建和篩選課件篩選流程篩選流程篩選從基因文庫的大量克隆中鑒定出某個(gè)含有目的基因的特定克隆的過程，稱為篩選篩選過程通常需要一個(gè)核酸探針進(jìn)行雜交，該探針可以與其互補(bǔ)序列結(jié)合從而檢測出含目的基因的克隆。將菌落或噬菌斑轉(zhuǎn)移到膜上，將其置入含放射性標(biāo)志探針溶液中保溫，檢出相應(yīng)克隆。通常構(gòu)建核酸探針，要求了解其基因序列或表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）的信息篩選從基因文庫的大量克隆中鑒定出某個(gè)含有目的基因的特定克隆的探針的制作方法

用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）制作探針從目的基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）的序列信息，可以派生出其可能的DNA序列混合物，根據(jù)該序列信息，可以采用PCR技術(shù)構(gòu)建核酸探針PCR探針寡聚核苷酸探針：合成儀探針的制作方法用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）制作探針平板雜交篩選克隆DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上；膜上的DNA在堿性條件下變性，解聚形成單鏈；再通過烤膜或紫外線照射，單鏈將與膜緊密結(jié)合；再將膜置于含有放射性標(biāo)記的核酸探針的溶液中保溫，使探針與其互補(bǔ)序列進(jìn)行雜交；雜交后充分洗去未雜交的探針，然后可由放射性自顯影鑒定。平板雜交篩選克隆DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上；膜上的DNA在堿性條件（1）原位雜交篩選特點(diǎn)：對應(yīng)的菌斑或噬菌斑位置不變，可以直接找出陽性菌落。原位雜交篩選

（1）原位雜交篩選特點(diǎn)：對應(yīng)的菌斑或噬菌斑位置不變，可以直接找出陽性菌落。（1）原位雜交篩選特點(diǎn)：對應(yīng)的菌斑或噬菌斑位置不變，可以直接基因組文庫、cDNA文庫的構(gòu)建和篩選課件寡聚核苷酸探針寡聚核苷酸探針抗體探針表達(dá)篩選通過抗體篩選來檢測cDNA編碼的蛋白質(zhì)抗體探針表達(dá)篩選通過抗體篩選來檢測cDNA編碼的蛋白質(zhì)質(zhì)粒蛋白A外源蛋白BcDNA表達(dá)為與β半乳糖苷酶相嵌合的目的基因的融合蛋白，用抗血清來篩選目的cDNA編碼的融合蛋白。篩選流程與噬菌斑雜交程序相似。質(zhì)粒蛋白A外源蛋白BcDNA表達(dá)為與β半乳糖苷酶相嵌合的目的雜交扣留和釋放cDNA與mRNA雜交后可抑制某些mRNA的翻譯(雜交扣留翻譯).雜交的mRNA被純化后進(jìn)行翻譯(雜交釋放翻譯)可鑒定cDNA克隆編碼的蛋白

雜交扣留和釋放cDNA與mRNA雜交后可抑制某些mRNA的翻染色體步移(Chromosomewalking)從文庫中分離相鄰基因組克隆來克隆目的基因即為染色體步移.

染色體步移(Chromosomewalking)從文庫中染色體步移是先用與疾病基因最接近的標(biāo)記DNA做為探針從基因庫找出一個(gè)能夠與它雜交的DNA片段。這個(gè)片段應(yīng)當(dāng)包含標(biāo)記DNA的序列。假使這片段夠長的話，它也有可能包含所要的疾病基因，問題就此解決。不過，基因庫內(nèi)的DNA片段長度有限。如果疾病基因與標(biāo)記DNA的距離比載體攜帶的DNA片段還長，用標(biāo)記DNA篩選出的DNA片段必定沒有包含疾病基因。染色體步移是先用與疾病基因最接1980年代，研究人員迫切地尋找CFTR及HD基因時(shí)尚無YAC可用。疾病基因與標(biāo)記DNA