雙熒光素酶檢測原理和方法總結(jié)

miRNA靶基因驗證實驗原理：哺乳動物中不含內(nèi)源性熒光素酶，轉(zhuǎn)錄完成后生成有功能性的熒光素酶，其光產(chǎn)物具有交到的量子效率，檢測靈敏度高，已被廣泛應用于miRNA靶基因檢測。一般截取mRNA3’UTR（野生型、突變型）區(qū)域100bp長度構(gòu)建到熒光素酶質(zhì)粒上牙UTRtargetSV40IRESLuciferaseINTERACTIONNOINTERACTIONmicraRNARISCcomplexmrercRNARISCcomplexIIRES-LucTranslati-onLOWLEVELLUCTRANSLATIONLuciferase■IRES-Luc *牙UTRtargetSV40IRESLuciferaseINTERACTIONNOINTERACTIONmicraRNARISCcomplexmrercRNARISCcomplexIIRES-LucTranslati-onLOWLEVELLUCTRANSLATIONLuciferase■IRES-Luc *TranslalignLUCrFWNSLATlONWUUUk*Luciferase實驗方法：質(zhì)粒構(gòu)建預測mRNA與miRNA的結(jié)合位點后，截取結(jié)合位點前后100bp長度構(gòu)建到pmirGLO載體上，同時構(gòu)建結(jié)合區(qū)域突變載體，如：pmirGLO-mRNA-3’UTR、pmirGLO-mut-mRNA-3’UTR合成miRNAmimics及NC對照；細胞轉(zhuǎn)染，細胞分組：（1）pmirGLO-mRNA-3’UTR+miRNAmimics（2） pmirGLO-mRNA-3’UTR+miRNAmimicsNC（3） pmirGLO-mut-mRNA-3’UTR+miRNAmimics（4） pmirGLO-mut-mRNA-3’UTR+miRNAmimicsNC化學發(fā)光檢測細胞Luciferas表達活性；5.數(shù)據(jù)分析。操作流程：1、 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染1） 將指數(shù)期細胞傳到孔板中，轉(zhuǎn)染時細胞密度約為70%；2） 根據(jù)轉(zhuǎn)染的孔的大小，按照一定比例混勻質(zhì)粒；3） 取一個新的1.5ml離心管，加入lipofectamine2000和Opti-MEM，輕輕混勻后室溫靜置5min；4） 將4中的混合液加入3的EP管中，混勻；5） 室溫靜置20min，將lipofectamine2000-質(zhì)粒混合液滴到U孔板中；6） 4h后換回含血清的完全培養(yǎng)基。2、 Luciferase活性檢測1） 取出細胞，室溫下吸去培養(yǎng)基，1xPBS洗一遍，每孔加入100ul1xpassivelysisbuffer。2） 把孔板放在搖床上搖15min，轉(zhuǎn)移到EP管中用于后續(xù)實驗或儲存。3） 準備好底物、將LARII從-80°C中取出解凍；StopandGlo:把50xStopandGlosubstrate用StopandGlobuffer酉己成1x；避光放置。4） 把細胞裂解液轉(zhuǎn)移到標記好EP管中、瞬時離心；5） 標記好測量管、每管加入適量細胞裂解液；6） 按說明書設置程序；7） 每測量管加入100ulLARII溶液、快速混勻、測量；8）每測量管加入100ulStopandGlo溶液、快速混勻、測量;9）整理數(shù)據(jù)。試劑：Lipofectamine?2000