β-內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物-課件

β-內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物醫(yī)學(xué)課件1β-內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物醫(yī)學(xué)課件1一.高分子聚合物的研究（一）β-內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物的定義與分類1.定義藥物中的高分子聚合物系指藥物中分子量大于藥物本身的雜質(zhì)的總稱。其分子量一般在1000～5000，個別可至10000道爾頓左右。醫(yī)學(xué)課件2一.高分子聚合物的研究（一）β-內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物2.來源與分類β-內(nèi)酰胺類抗生素藥物中的高分子雜質(zhì)按其來源可分為兩類：外源性雜質(zhì)與內(nèi)源性雜質(zhì)。2.1外源性雜質(zhì)：一般來源于發(fā)酵工藝，為蛋白、多肽、多糖等雜質(zhì)或與抗生素結(jié)合的雜質(zhì)。如：青霉素中的青霉噻唑蛋白，青霉噻唑多肽。醫(yī)學(xué)課件32.來源與分類醫(yī)學(xué)課件32.2內(nèi)源性雜質(zhì)：系指抗生素藥物自身聚合產(chǎn)物。聚合物即可來自生產(chǎn)過程，又可在儲存過程中形成；甚至在用藥時也可以產(chǎn)生，如阿莫西林顆粒。隨著現(xiàn)代生產(chǎn)工藝的不斷改進和提高，目前產(chǎn)品中外源性雜質(zhì)日趨減少，故對內(nèi)源性聚合物的控制是當前抗生素藥物高分子雜質(zhì)控制的重點。醫(yī)學(xué)課件42.2內(nèi)源性雜質(zhì)：系指抗生素藥物自身聚合產(chǎn)物。聚合物即可來自（二）β-內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)的形成機理及結(jié)構(gòu)特征β-內(nèi)酰胺類抗生素主要包括青霉素和頭孢菌素兩大類。醫(yī)學(xué)課件5（二）β-內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)的形成機理及結(jié)構(gòu)特征醫(yī)學(xué)課醫(yī)學(xué)課件6醫(yī)學(xué)課件6除青霉素G和V外,臨床中常用的β-內(nèi)酰胺類抗生素均為半合成抗生素,故除青霉素G和V中還含有少量的青霉噻唑蛋白外,其他制劑中的高分子雜質(zhì)主要是聚合物。1.

青霉噻唑蛋白，多肽制劑中青霉噻唑蛋白，多肽的分子量主要分布在2400～3500，由青霉素的β-內(nèi)酰胺環(huán)和多肽上的伯氨基按親核反應(yīng)機理縮合而成，主要在發(fā)酵工藝中形成，高pH環(huán)境有利于縮合反應(yīng)的進行；樣品在儲存過程中，多肽類雜質(zhì)殘留的自由氨基仍能和β-內(nèi)酰胺環(huán)反應(yīng)，直至飽和。醫(yī)學(xué)課件7除青霉素G和V外,臨床中常用的β-內(nèi)酰胺類抗生素均為半合成抗1.

青霉素聚合物青霉素的聚合反應(yīng)可按兩種方式進行：（1）

反應(yīng)僅和母核結(jié)構(gòu)有關(guān)，側(cè)鏈中的活性基團不參與反應(yīng)。醫(yī)學(xué)課件81.

青霉素聚合物醫(yī)學(xué)課件8（1）

側(cè)鏈參與的聚合反應(yīng)主要以氨芐青霉素為代表，反應(yīng)時側(cè)鏈的氨基親核攻擊β-內(nèi)酰胺抗生素的羰基碳原子，形成聚合物。

醫(yī)學(xué)課件9（1）

側(cè)鏈參與的聚合反應(yīng)醫(yī)學(xué)課件91.

頭孢菌素的聚合反應(yīng)也包括兩種類型：只依賴于母核的N型聚合反應(yīng)和側(cè)鏈參與的L型聚合反應(yīng)。對于7位側(cè)鏈中不含有自由氨基的頭孢菌素只能發(fā)生N型聚合反應(yīng)。醫(yī)學(xué)課件101.

頭孢菌素的聚合反應(yīng)也包括兩種類型：醫(yī)學(xué)課件10(三)β-內(nèi)酰胺類抗生素質(zhì)量和過敏反應(yīng)的關(guān)系引發(fā)過敏反應(yīng)的過敏原a.

分子量大b.

具有一定抗原決定簇青霉素過敏反應(yīng)中主要抗原決定簇——青霉噻唑基（BPO）頭孢菌素過敏反應(yīng)中主要抗原決定簇——7位R1側(cè)鏈c.

多價醫(yī)學(xué)課件11(三)β-內(nèi)酰胺類抗生素質(zhì)量和過敏反應(yīng)的關(guān)系醫(yī)學(xué)課件11β-內(nèi)酰胺類抗生素本身并不是過敏原，而只有當它們與蛋白、多肽、多糖等大分子載體共價結(jié)合成全抗原或本身聚合成多價半抗原后才能引發(fā)過敏反應(yīng)。醫(yī)學(xué)課件12β-內(nèi)酰胺類抗生素本身并不是過敏原，而只有當它們與蛋白、多肽（四）.影響聚合物形成的因素1.

青霉素的聚合物青霉素的聚合物反應(yīng)速度在液體條件下和溶液的酸堿度關(guān)系密切；在固體條件下主要和樣品的水分含量有關(guān)。2.

頭孢菌素的聚合物固體狀態(tài)下頭孢菌素類產(chǎn)品聚合速度與含水量和貯存溫度關(guān)系密切，試驗表明，貯存溫度較低時，含水量差異堆聚合物含量盡管有影響，但影響不大。但當貯存溫度上升至37攝氏度時含水量差異對聚合物含量的影響十分顯著。3.工藝不同如氨芐青霉素有溶媒結(jié)晶和噴霧干燥兩種，一般后者的聚合物要明顯多于前者。醫(yī)學(xué)課件13（四）.影響聚合物形成的因素醫(yī)學(xué)課件13（五）.口服青霉素類藥物使用前進行皮試的必要性口服青霉素，如青霉素V鉀與其他注射用青霉素一樣可以形成高分子聚合物，其聚合速度與藥物濃度、反應(yīng)溫度及pH等有關(guān)。制備的青霉素V聚合物的豚鼠皮膚被動過敏試驗（PCA）陽性，口服青霉素V高聚物后，30分鐘血清中可檢出高聚物；在30分鐘到1小時可引發(fā)豚鼠PCA反應(yīng)陽性，從而證明青霉素中高分子聚合物可經(jīng)胃腸道吸收而引發(fā)過敏反應(yīng)。醫(yī)學(xué)課件14（五）.口服青霉素類藥物使用前進行皮試的必要性醫(yī)學(xué)課件14二.高分子雜質(zhì)分析方法（一）概述：國內(nèi)外已有許多分離、分析β-內(nèi)酰胺類抗生素中高分子雜質(zhì)的報道。色譜法是主要分離分析的方法。其分離模式有三類：（1）反相模式（2）離子交換模式（3）凝膠色譜模式由于結(jié)構(gòu)不同的高分子雜質(zhì)通常有相似的生物學(xué)特性，因此，在藥品質(zhì)量控制中一般不需分別控制不同結(jié)構(gòu)的高分子雜質(zhì)含量，而只需控制商品中高分子雜質(zhì)的總量。故根據(jù)分子量差異進行分離的凝膠色譜模式是簡便易行的分離模式。醫(yī)學(xué)課件15二.高分子雜質(zhì)分析方法醫(yī)學(xué)課件15（一）凝膠色譜分析法的原理：1.

分離原理利用凝膠色譜的分子篩機制，讓藥物分子自由進入凝膠顆粒內(nèi)部，而高分子雜質(zhì)被排阻不能進入，在色譜過程中不被保留，最早被流動相洗脫。2.

凝膠介質(zhì)根據(jù)β-內(nèi)酰胺類抗生素和其高分子雜質(zhì)分子量的特點，比較數(shù)種凝膠介質(zhì)，最后選用SephadexG-10作為凝膠介質(zhì)（排阻分子量在1000道爾頓左右）。醫(yī)學(xué)課件16（一）凝膠色譜分析法的原理：醫(yī)學(xué)課件16（一）分析方法1.

系統(tǒng)適用性試驗為保證不同實驗室間測定的精密度符合規(guī)定，要求方法系統(tǒng)適應(yīng)性參數(shù)：理論板數(shù)及拖尾因子：用藍色葡聚糖2000的溶液（1mg/ml）作為參比溶液，測定在流動相A、B中的Kav＝0的保留時間，并計算出理論板數(shù)及拖尾因子。在兩種流動相系統(tǒng)中藍色葡聚糖2000峰的保留時間比值應(yīng)在0.93～1.07之間，對照溶液主峰與供試品溶液中聚合物峰與相應(yīng)色譜系統(tǒng)中藍色葡聚糖2000峰的保留時間比值應(yīng)為0.93～1.07。藥物分子和凝膠介質(zhì)間的相互作用和藥物的結(jié)構(gòu)有關(guān)。其色譜分析受色譜條件如：流動相的組成、濃度、pH、流速等因素的影響。所以可通過改變色譜調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)藥物分子和凝膠介質(zhì)間的相互作用，使高分子雜質(zhì)和藥物分子間的分離良好，通過對流動相與洗脫速度的優(yōu)化，已成功建立數(shù)十種β-內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)的分析方法。醫(yī)學(xué)課件17（一）分析方法醫(yī)學(xué)課件172.

自身對照的外標法由于β-內(nèi)酰胺抗生素的高分子雜質(zhì)具有高度的不均一性和不確定性，高聚物本身不穩(wěn)定，不易制備。用高聚物本身作為對照的外標法定量有一定難度。同時由于高分子雜質(zhì)含量較低，進樣量一般相對較大，是藥物本身色譜峰十分寬大，導(dǎo)致主峰的峰面積積分誤差較大，因此也限制了面積歸一化法的應(yīng)用。試驗證明，在特定條件下，β-內(nèi)酰胺抗生素可締合形成表觀分子量較大的締和物，締和物在SephadexG-10凝膠色譜系統(tǒng)種色譜行為與高分子雜質(zhì)一樣，都在Kav＝0處表現(xiàn)為單一色譜峰，利用這一特點，在SephadexG-10凝膠色譜系統(tǒng)種制定了新的定量方法——自身對照外標法。醫(yī)學(xué)課件182.

自身對照的外標法醫(yī)學(xué)課件18三．2005年版β-內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物法增修訂概況醫(yī)學(xué)課件19三．2005年版β-內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物法增修訂概況醫(yī)（一）.修訂內(nèi)容1.

對原收載的8個品種的色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗均與新增品種項下書寫格式相同。2.

系統(tǒng)適用性試驗：統(tǒng)一為理論板數(shù)以藍色葡聚糖2000峰計算均不低于…。拖尾因子均應(yīng)小于2.0，在兩種流動相系統(tǒng)中藍色葡聚糖2000峰保留時間比值均應(yīng)在0.93～1.07之間；對照溶液主峰與供試品溶液中聚合物峰與相應(yīng)色譜系統(tǒng)中藍色葡聚糖2000峰保留時間的比值均應(yīng)在0.93～1.07。3.

對照品溶液修改為對照溶液4.

頭孢他啶聚合物項下，流動相A由原來的含3.5％硫酸銨的pH7.0的0.01M磷酸鹽緩沖液修訂為含3.5％硫酸銨的pH7.0的0.1M磷酸鹽緩沖液。醫(yī)學(xué)課件20（一）.修訂內(nèi)容醫(yī)學(xué)課件20四.操作要點(一).色譜條件中流動相A的組成與濃度，pH值及流速對測定結(jié)果的影響。1.

流動相的組成與濃度：本方法流動相為磷酸鹽緩沖液。用不同濃度的磷酸鹽緩沖液作為流動相時，藥物分子的色譜行為隨其濃度的增加，主峰的保留時間也隨之增大。2.

流動相的pH值對聚合物檢出的影響：相同濃度，pH不同，樣品分離情況也不同，如阿莫西林在pH7.0的0.05M磷酸鹽緩沖液分析時無聚合物峰檢出，而改用pH8.0的0.05M磷酸鹽緩沖液則分離良好。3.

流速：調(diào)節(jié)流速可改變色譜峰的保留時間，已達到最佳分離效果。醫(yī)學(xué)課件21四.操作要點醫(yī)學(xué)課件21（二）.有關(guān)對照溶液測定的幾個注意點試驗證明，β-內(nèi)酰胺類抗生素在特定的條件下，如水，0.01％SDS或0.5％葡萄糖溶液作為流動相B，可締合成表觀分子量極大的締和物，其色譜行為與高分子雜質(zhì)一樣，都在Kav＝0流出，表現(xiàn)為單一色譜峰，利用這一特點，作為測定方法中新的定量法——自身對照外標法。但由于β-內(nèi)酰胺類抗生素品種繁多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，故在研究制定各品種方法學(xué)時，出現(xiàn)以下幾個問題：醫(yī)學(xué)課件22（二）.有關(guān)對照溶液測定的幾個注意點醫(yī)學(xué)課件221.

有關(guān)對照溶液保留時間與藍色葡聚糖2000峰保留時間不一致的問題。如頭孢拉定，可能SephedexG-10對頭孢拉定有一定吸附作用引起，可以通過用0.2M氫氧化鈉和0.5M氯化鈉溶液約350ml沖洗凝膠柱，然后用水沖洗至中性，使凝膠柱活化，改善保留時間不一致情況。醫(yī)學(xué)課件231.

有關(guān)對照溶液保留時間與藍色葡聚糖2000峰保留時1.

標準中系統(tǒng)適用性試驗項下要求：取對照溶液連續(xù)進樣5次，其峰面積相對標準偏差應(yīng)不大于5.0%。經(jīng)試驗證明，青霉素鈉，頭孢曲松鈉，頭孢呋辛鈉等大部分品種均能符合要求，且五次記錄的色譜圖峰的重現(xiàn)性好，但阿莫西林連續(xù)五次進樣，峰高逐漸降低，而峰寬逐漸增加，色譜柱用上述方法處理活化后略有改善，但仍不可能道道五個峰的重疊。以上現(xiàn)象可能與阿莫西林分子結(jié)構(gòu)有關(guān)?？紤]阿莫西林為青霉素的半合成產(chǎn)物，結(jié)構(gòu)中有與青霉素相似的母核，而其分子量也較接近，而青霉素在水中的締合物穩(wěn)定，重現(xiàn)性好故決定用青霉素作為對照品，并加校正因子計算結(jié)果。醫(yī)學(xué)課件241.

標準中系統(tǒng)適用性試驗項下要求：取對照溶液連續(xù)進樣

β-內(nèi)酰胺類個別品種在特定條件下出現(xiàn)不能完全締合現(xiàn)象。如硫酸頭孢噻利，硫酸頭孢匹羅。醫(yī)學(xué)課件25

β-內(nèi)酰胺類個別品種在特定條件下出現(xiàn)不能完全締合現(xiàn)象。醫(yī)學(xué)（三）.樣品測定的幾個注意點1.

低聚物對高聚物分離度的影響。醫(yī)學(xué)課件26（三）.樣品測定的幾個注意點醫(yī)學(xué)課件261.

實驗結(jié)果的積分處理凝膠色譜結(jié)果的特殊性a.

色譜峰不能達到基線分離b.

色譜峰的對稱性較差或拖尾嚴重上述情況帶來數(shù)據(jù)處理的復(fù)雜性，難以調(diào)整峰寬、斜率等參數(shù)得到合理的積分值。醫(yī)學(xué)課件271.

實驗結(jié)果的積分處理醫(yī)學(xué)課件27（四）.有關(guān)實驗技術(shù)1.

凝膠的預(yù)處理要求新使用的凝膠：充分溶脹室溫20攝氏度需3小時以上，煮沸需1小時已使用過的凝膠再生：先用0.2MNaOH與0.5MNaCl混合液浸泡半小時后用水洗至中性，裝柱。醫(yī)學(xué)課件28（四）.有關(guān)實驗技術(shù)醫(yī)學(xué)課件281.

裝柱要點a.

凝膠漿濃度應(yīng)適合（一般為70％）水混懸液，分散均勻不結(jié)團（不宜強烈攪拌）。b.

避免空氣泡。c.

填充時應(yīng)盡可能使?jié){液均勻分布，防止分層與氣泡產(chǎn)生。醫(yī)學(xué)課件291.

裝柱要點醫(yī)學(xué)課件291.

色譜柱維護保養(yǎng)a.

葡聚糖凝膠耐受壓力為0.3兆帕，過高壓力會損傷填料性能。b.

防止柱子長霉可用20％乙醇或0.04％疊氮鈉保存。c.

防止柱子受污染可用0.2M氫氧化鈉和0.5M氯化鈉混合液沖洗凝膠柱，然后用水沖洗至中性醫(yī)學(xué)課件301.

色譜柱維護保養(yǎng)醫(yī)學(xué)課件301.

系統(tǒng)適應(yīng)性試驗要求（1）

藍色葡聚糖2000色譜行為的特殊意義a.

保留時間表示流動相流速確定條件下的Kav＝0的洗脫時間，即相當于被排阻的聚合物洗脫的保留時間。b.

該保留時間與柱效及