發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)桑樹毛狀根體系的建立

發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)桑樹毛狀根體系的建立孔衛(wèi)青;楊金宏;盧從德【摘要】應(yīng)用發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060,以直接接種和共培養(yǎng)2種方法侵染桑樹10d齡子葉，并將2種處理的外植體分別接種于MS+AS（乙酰丁香酮,100pmol/L）的平板,暗培養(yǎng)2d后轉(zhuǎn)接至MS+CS（頭孢霉素,200mg/L）平板培養(yǎng)3周，每3d轉(zhuǎn)接1次以除去其中所含的發(fā)根農(nóng)桿菌菌體，結(jié)果2種侵染方法均成功誘導(dǎo)桑樹產(chǎn)生毛狀根，誘導(dǎo)效率分別為14%和17%.在無激素MS培養(yǎng)基上離體培養(yǎng)除菌后的毛狀根，呈現(xiàn)旺盛的生長態(tài)勢(shì)和典型的發(fā)狀根結(jié)構(gòu)特點(diǎn).CTAB法提取毛狀根基因組并進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果擴(kuò)增出了423bp的rolB基因片段，表明Ri質(zhì)粒的T-DNA已經(jīng)成功整合到桑樹的基因組中.【期刊名稱】《西北植物學(xué)報(bào)》【年（卷），期】2010（030）011【總頁數(shù)】4頁（P2317-2320）【關(guān)鍵詞】桑樹;發(fā)根農(nóng)桿菌;毛狀根;誘導(dǎo)【作者】孑L衛(wèi)青;楊金宏;盧從德【作者單位】安康學(xué)院，陜西省蠶桑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西安康,725000;安康學(xué)院，陜西省蠶桑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西安康,725000;安康學(xué)院，陜西省蠶桑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西安康,725000【正文語種】中文【中圖分類】Q789Abstract:Usingdirectinfectionandco2culturingwithbacteriamethod,102daysmulberrycotyledonwerewound2inoculatedwithAgrobacteriumrhizogenesstrainsACCC10060inordertoobtainhairyroots.Ex2plantswereculturedindark2daysontheMS+AS(Acetosyringone,100pmol/L),thentransferredontoMS+CS(Cefotaximsodium,200mg/L)inordertocurethebacteria,andreplacedevery3daysfor3weeks.Bothinfectionmethodsweresuccessfullyobtainedmulberryhairyroots,andtherateofinductionare14%and17%,respectively.TherootgrewvigorouslyonMSmediumwithoutanyhormoneandhashairyrootcharacters.GenomicDNAofthehairyrootswasextractedbyCTABmethodanda423bpfrag2mentwasamplifiedwithprimersofrolB,indicatedthatT2DNAofRihadintegratedintomulberrygenome.Keywords:mulberry;Agrobacteriumrhizogenes;hairyroots;induction根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)和發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)均是革蘭氏陰性土壤細(xì)菌，分別應(yīng)用其Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒侵染植物傷口進(jìn)入細(xì)胞,并將其上含有的一段T2DNA插入到植物基因組中［1］。但因?yàn)橐吧透┺r(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T2DNA上具有致病基因，該基因的表達(dá)和植株再生不相容，所以通常將目的基因插入到經(jīng)過維呷”改造的T2DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實(shí)現(xiàn)外源基因向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與整合，然后通過細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出轉(zhuǎn)基因植株［2］。而野生型發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒的TL2DNA上有rolA2D基因群,TR2DNA有tms基因,能誘發(fā)被感染植物的受傷部位產(chǎn)生大量的毛狀根［3］,且Ri質(zhì)粒T2DNA上的基因不影響植株的再生，轉(zhuǎn)化效率高啟前已在甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)、煙草(Nicotianataba2cumL.)、藍(lán)豬耳(ToreniafournieriL.)、鈍莨菪(Hy2oscyamusmuticusL.)等中獲得成功［427］。同時(shí)，發(fā)根農(nóng)桿菌也可以轉(zhuǎn)化雙元Ti質(zhì)粒，將Ti質(zhì)粒上的一段DNA整合進(jìn)植物基因組,穩(wěn)定地遺傳給后代，且發(fā)根農(nóng)桿菌能夠感染大多數(shù)雙子葉植物和少數(shù)單子葉植物及裸子植物，所以利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)植物細(xì)胞產(chǎn)生毛狀根是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來并得到廣泛應(yīng)用的植物基因工程技術(shù)，在植物代謝物的生產(chǎn)上顯示了巨大的應(yīng)用潛力［8,9］。桑樹(MorusalbaL.)是蠶桑生產(chǎn)的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)桑樹中也含有大量的次生代謝物,具有重要的經(jīng)濟(jì)和研究價(jià)值。在桑樹的基因工程研究上啟MachiiH采用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtu2mefaciens)葉盤轉(zhuǎn)化系統(tǒng)成功地將外源基因?qū)肷Ｈ~盤，并獲得轉(zhuǎn)化株以來，根癌農(nóng)桿菌在桑樹的基因工程上得到了廣泛的應(yīng)用［10］。Sandhya等［11］利用根癌農(nóng)桿菌和桑細(xì)胞共培養(yǎng)的方法也獲得了轉(zhuǎn)化植株。陸小平等［12］用根癌農(nóng)桿菌整株轉(zhuǎn)化方法對(duì)真葉開放期的桑苗進(jìn)行試驗(yàn)，也成功獲得了桑樹的轉(zhuǎn)基因植株。但目前還沒有利用發(fā)根農(nóng)桿菌進(jìn)行桑樹毛狀根誘導(dǎo)及轉(zhuǎn)基因研究的報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)利用發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060侵染桑樹10d齡子葉，成功建立了一種簡單、易于操作的發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的桑樹毛狀根的誘導(dǎo)體系，為桑樹的轉(zhuǎn)基因和桑樹毛狀根次生代謝物的研究利用奠定了基礎(chǔ)。1.1植物夕卜植體的準(zhǔn)備選取當(dāng)年收獲的桑樹’沙2’品種的種子，蒸餾水沖洗1h,75%乙醇浸泡15min,30%H2O2浸泡5min,無菌水沖洗4~6次后，無菌濾紙吸干表面水分。用酒精燈灼燒消毒后的鑷子將消毒后的種子接種于MS固體平板上,置于25°C,12h光照條件下培養(yǎng)，約1周后種子萌發(fā)，長出子葉。暗培養(yǎng)2~3d,待用。1.2供試菌株的活化供試菌株為野生型發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060,購自中國農(nóng)業(yè)微生物保藏中心。劃線發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060于YEB平板,25C避光培養(yǎng)2d長出菌落，連續(xù)劃線活化培養(yǎng)2次后，應(yīng)用2種方法對(duì)供試菌株進(jìn)行再次活化。方法一:繼續(xù)劃線平板培養(yǎng)一次。方法二挑單菌落于YEB液體培養(yǎng)基中,25^,180r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6~0.8,離心收集菌體，用MS培養(yǎng)基重懸至OD600為1.0。1.3桑樹毛狀根的誘導(dǎo)用直接接種法和共培養(yǎng)法誘導(dǎo)桑樹產(chǎn)生毛狀根。（1） 直接接種法用刀片切下1.1中萌發(fā)種子長出的子葉,接種針輕微創(chuàng)傷子葉正面,再于1.2方法一活化的發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060菌斑上輕輕蘸下。（2） 共培養(yǎng)法將創(chuàng)傷后的桑樹子葉置于1.2方法二活化并重懸于MS培養(yǎng)基的發(fā)根農(nóng)桿菌AC2CC10060菌液中10min。將2種處理的外植體分別接種于MS+AS（乙酰丁香酮,100Mmol/L）的平板，暗培養(yǎng)2d后，轉(zhuǎn)接至MS+CS（頭孢霉素,200mg/L）平板上繼續(xù)培養(yǎng)，每3d轉(zhuǎn)接1次以除去其中所含的發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060的菌體。1.4毛狀根的離體培養(yǎng)與PCR檢測(cè)剪取經(jīng)3周除菌培養(yǎng)后的毛狀根根尖2~3cm,置于MS培養(yǎng)基進(jìn)行離體培養(yǎng)。根據(jù)發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060的Ri質(zhì)粒的TL2DNA上的rolB基因的序列設(shè)計(jì)引物,然后PCR擴(kuò)增rolB基因,以檢測(cè)其是否成功轉(zhuǎn)入桑樹，引物序列為rolBF:5'2GCTCTTGCAGTGCTAGATTT23，;rolBRS2GA2AGGTGCAAGCTACCTCTC23',引物由上海生工生物工程有限公司合成。取除菌完全的毛狀根基部適量,CTAB法提取基因組DNA,同時(shí)用正常桑樹葉片的基因組DNA做對(duì)照,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)采用25"體系,程序?yàn)?4°C預(yù)變性4min;95°C30s;57C30s;72C40s,30個(gè)循環(huán);最后72C再延伸6min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳,EB染色，紫外燈下檢測(cè)。2.1不同方法誘導(dǎo)桑樹產(chǎn)生毛狀根的效率應(yīng)用直接接種法和共培養(yǎng)法進(jìn)行發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060侵染桑樹子葉，外植體經(jīng)MS+AS（乙酰丁香酮,100pmol/L）平板、MS+CS（頭孢霉素,200mg/L）平板培養(yǎng),2種侵染方法均成功誘導(dǎo)桑樹產(chǎn)生毛狀根,其中共培養(yǎng)法的誘導(dǎo)桑樹產(chǎn)生毛狀根的效率為17%,直接接種法為14%（表1）,共培養(yǎng)方法的誘導(dǎo)效率高于直接接種法。但由于直接接種法操作方便，而且該方法誘導(dǎo)產(chǎn)生的桑樹毛狀根的生長速度快于共培養(yǎng)法因此，本研究后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用直接接種法誘導(dǎo)獲得的桑樹毛狀根進(jìn)行。2.2桑樹毛狀根的離體培養(yǎng)創(chuàng)傷的桑樹子葉經(jīng)直接接種法處理1周后，傷口部位長出白色突起,2周后分化為白色細(xì)根，且根的密度較大，生長速度快，生長的根向地性（圖1,A）。3周后毛狀根的顏色開始變黃,子葉逐漸枯萎（圖1,B）。此時(shí)分別剪取2-3cm根尖置于MS培養(yǎng)基進(jìn)行離體培養(yǎng)，離體的毛狀根能在MS培養(yǎng)基上自主生長，且生長速度快,形成大量分支,2個(gè)月后鮮重約為原來的20倍（圖1,C）。2.3桑樹毛狀根的PCR檢測(cè)取18個(gè)毛狀根組織提取基因組,進(jìn)行rolB基因的PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增到一條423bp的條帶，與預(yù)期大小一致，而同時(shí)以正常桑葉片的基因組DNA為模板沒能擴(kuò)增到該條帶（圖2）,說明Ri質(zhì)粒的T2DNA已經(jīng)成功整合到桑樹的基因組中,所獲得的毛狀根為發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)生的遺傳轉(zhuǎn)化體。共培養(yǎng)方法是誘導(dǎo)毛狀根的一種經(jīng)典方法具有廣泛的應(yīng)用。但該方法操作相對(duì)復(fù)雜,對(duì)實(shí)驗(yàn)者的操作技能有一定的要求，同時(shí)需要使用一些大型的設(shè)備。本研究同時(shí)使用了共培養(yǎng)和直接接種法，雖然共培養(yǎng)的誘導(dǎo)效率略高于直接接種法,但差異不大,而相對(duì)于共培養(yǎng)方法,直接操作法操作簡便，不需要低溫離心機(jī)等大型的貴重儀器，適合大多數(shù)的科研院所使用。發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)植物產(chǎn)生毛狀根的影響因素很多，如菌液濃度、共培養(yǎng)時(shí)間、AS濃度等［13,14］。其中菌液濃度是轉(zhuǎn)化過程中常常被調(diào)整的因素，菌液濃度過高,發(fā)根農(nóng)桿菌生長過快，不易被抗生素殺死.易導(dǎo)致外植體受到傷害、發(fā)生褐化甚至死亡；菌液濃度過低，又無法感染外植體。本實(shí)驗(yàn)采用的創(chuàng)傷子葉直接接種發(fā)根農(nóng)桿菌的方法基本忽略了上述因素,操作簡單且容易重復(fù)。這也可能與實(shí)驗(yàn)采用子葉為夕卜植體有關(guān)子葉特別肥厚，貯藏著大量的營養(yǎng)物質(zhì)，誘導(dǎo)的過程中可提高生根率,且不會(huì)因?yàn)榫簼舛冗^大而導(dǎo)致死亡。毛狀根可在離體培養(yǎng)條件下表現(xiàn)出次生代謝產(chǎn)物的合成能力，還能夠合成許多懸浮細(xì)胞培養(yǎng)所不能合成的物質(zhì)，某些產(chǎn)物的產(chǎn)量甚至高于正常植物及懸浮細(xì)胞培養(yǎng)[15]。因此，毛狀根培養(yǎng)系統(tǒng)在生物量的增加、藥用有效成分的積累以及生產(chǎn)穩(wěn)定性方面，都顯示了其獨(dú)特的優(yōu)越性。到目前為止，國內(nèi)夕卜現(xiàn)已成功地培養(yǎng)出黃芪、紫草、紅花、青蒿、決明等藥用植物的毛狀根，人參皂或、黃連素等已通過毛狀根培養(yǎng)得以工業(yè)化生產(chǎn)[16]。桑樹的根中含有大量的次生代謝物質(zhì)，具有重要的研究價(jià)值，而桑樹毛狀根的研究在國內(nèi)外尚屬空白，本實(shí)驗(yàn)描述了一種簡便易行的桑樹毛狀根誘導(dǎo)方法，成功獲得了桑樹的毛狀根，為桑樹毛狀根次生代謝物的利用和桑樹轉(zhuǎn)基因研究奠定了基礎(chǔ)?！鞠嚓P(guān)文獻(xiàn)】GELVINSB.Findingawaytothenucleus[J].Cur.OpinioninMicrobiol,2010,13:53-58.HOEKEMAA,HIRSCHPR.AbinaryplantvectorstrategybasedonseparationofvirandTregionoftheAgrobacteriumtumefaciensTi2plasmid[J].Nature,1983,303:179-180.SCHMBLLINGT,SCHELLJ,SPENAA.PromotersoftherolA,BandCgenesofAgrobacteriumrhizogenesaredifferentiallyregulatedintransgenicplants[J].PlantCell,1989,1:665-670.LUHY,LIUJM,ZHANGHC,TAOY,GAOSL.Ri2mediatedtransformationofGlycyrrhizauralensiswithasqualenesynthasegene（GuSQS1）forproductionofglycyrrhizin[J].PlantMol.Biol.Rep.,2008,26:1-11.CUIH（崔紅）,MUPL（慕平利）,LIXJ（李雪君）,LIUML（劉夢(mèng)林）WANGZH（王^.Expressionoffarnesyldiphosphatesyn2thasegene（fps）inNicotinantabacumhairyrootviaRi2mediatedtransformation[J].JournalofZhejiangUniversity（Agriculture&LifeScience）（浙江大學(xué)學(xué)報(bào)?農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版）,2007,33（4）:355-359（inChinese）.TAOJ,LIL.GenetictransformationofToreniafournieriL.mediatedbyAgrobacteriumrhizogenes[J].SAfr.J.Bot.,2006,72:211-216.JOUHIKAINENK,JOKELAINENT,HILTUNENR,TEERITH,OKSMAN2CALDENTEYKM,LINDGRENL.EnhancementofscopolamineproductioninHyoscyamusmuticusL.hairyrootculturesbygeneticengineering[J].Planta,1999,208（4）:545-551.FUCX,ZHAODX,XUEXF,JINZP,MAFS.TransformationofSaussureainvolucratabyAgrobacteriumrhizogenes:Hairyrootin2ductionandsyringinproduction[J].ProcessBiochem.,2005,40:3789-3794.JINUH,CHUNJA,HANMO,LEEJW,YIYB,LEESW,CHUNGCH.Sesamehairyrootculturesforextra2cellularproductionofarecombinantfungalphytase[J].ProcessBiochem.,2005,40:3754-3762.MACHIIH.Leafdisktransformationofmulberryplant（MorusalbaL.）byagrobacteriumTiplasmid[J].SericultureScienceofJa2pan,1990,59:105-110.SANDHYAA,KAMLESHK,SAININ,JAINRK.AgrobacteriumtumefaciensmediatedgenetictransformationandregenerationofMorusalbaL.[J].ScientiaHorticulturae,2004,100:183-191.LUXP（陸小平）,LOUCHF（樓程富）,SHENFY（沈飛英）,MINEOK（小島拳雄）.MolecularidentificationandphenotypeanalysisoftransgenicmulberryplantbyAgrobacteriumtumefaciensT2DNAintroduction[J].Jour