基因重組技術(shù)課件

基因重組技術(shù)基因重組技術(shù)121概述

1.1定義

基因重組技術(shù)是一種在分子水平上按照人們設(shè)計的藍(lán)圖對基因進(jìn)行人工操作的技術(shù)，具體地說，就是從一種細(xì)胞中把目的基因提取出來，在體外把它和一種載體分子連接，然后用人工的方法將這種雜種DNA分子引入到另一種細(xì)胞中去，讓其大量復(fù)制繁殖或產(chǎn)生大量基因表達(dá)產(chǎn)物。21概述

1.1定義基因重組技術(shù)是一種在3別稱：基因工程（Geneengineering）

DNA重組(DNArecombination)

遺傳工程(Geneticengineering)

基因操作(Genemanipulation)

基因克隆(Genecloning)

分子克隆(Molecularcloning)……3別稱：4目的基因的分離；重組載體的選擇和制備；目的基因與載體的重組；重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞；重組克隆的篩選與鑒定；目的基因在受體細(xì)胞中的表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的分離純化。3基因重組技術(shù)

1概述

1.2基因重組技術(shù)的主要內(nèi)容和步驟基因重組技術(shù)的主要內(nèi)容4目的基因的分離；3基因重組技術(shù)

1概述

1.2基因重5分離重組轉(zhuǎn)化表達(dá)篩選

載體基因重組技術(shù)的主要步驟5分離重組轉(zhuǎn)化表達(dá)篩選載體基因重組技術(shù)的主要步驟6

定義是一類以環(huán)狀或線性雙鏈DNA為底物，能識別DNA中特定核苷酸序列，并在合適反應(yīng)條件下使每條鏈的一個磷酸二酯鍵斷開，產(chǎn)生具3’-OH和5’-P基團(tuán)DNA片段的內(nèi)脫氧核苷酸酶(endo-deoxyribonuclease)。

簡稱限制性內(nèi)切酶、限制酶、內(nèi)切酶。3基因重組技術(shù)

2基因重組技術(shù)的工具酶

2.1限制性核酸內(nèi)切酶(Restrictionendonuclease)——分子剪刀6定義3基因重組技術(shù)

2基因重組技術(shù)的工具酶

2.17種類目前，已從近300種不同的微生物分離出約500種限制性核酸內(nèi)切酶。類型（三種類型）型酶、型酶和型酶。若無說明，通常的限制性核酸內(nèi)切酶就是指型酶。7種類8

三種核酸限制性內(nèi)切酶的主要特性比較特性I型酶II型酶III型酶酶分子的結(jié)構(gòu)與功能三亞基多功能的酶單一功能的酶二亞基雙功能酶輔助因子ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸（SAM）Mg2+ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸識別序列特異性，非對稱序列特異性，旋轉(zhuǎn)對稱特異性，非對稱序列切割位點距特異性位點至少1000bp處隨機(jī)切割在識別序列內(nèi)部或附近特異切割距識別序列下游2426bp處切割在DNA克隆中的用途無用十分有用有用8三種核酸限制性內(nèi)切酶的主要特性比較特性I型酶II9識別序列

定義限制性核酸內(nèi)切酶在雙鏈DNA分子上能識別的特定核苷酸序列。又稱為識別位點、靶位點或切割位點。長度

4、5、6或7個核苷酸。結(jié)構(gòu)特點

具有雙重旋轉(zhuǎn)對稱結(jié)構(gòu)，即：回文結(jié)構(gòu)（palindromicsequence）。

GAATTC’

CTTAAG5’3’5’3’EcoRI9識別序列定義GAATTC’5’3’5’3’EcoR10切割方式已知大多數(shù)II型限制性核酸內(nèi)切酶在其識別序列內(nèi)部切割雙鏈DNA，水解磷酸二酯鍵中的3’位的酯鍵，產(chǎn)生3’端為羥基、5’端為磷酸基團(tuán)的片段。切割后形成3種不同末端結(jié)構(gòu)的DNA片段：在識別序列的對稱軸上同時切割，形成平頭末端（bluntend），如HaeIII；在識別序列的雙側(cè)末端切割，若于對稱軸的5’末端切割，可產(chǎn)生5’端突出的末端，如EcoRI；在識別序列的雙側(cè)末端切割，若于對稱軸的3’末端切割，可產(chǎn)生3’端突出的末端，如PstI。任何一種II型酶產(chǎn)生的兩個突出末端，都能在適當(dāng)溫度下，退火互補(bǔ)，因此這種末端稱為黏性末端（cohesiveend）。10切割方式已知大多數(shù)II型限制性核酸內(nèi)切酶在其識別序列內(nèi)部11平頭末端5’

粘性末端3’

粘性末端11平頭末端5’粘性末端3’粘性末端12限制性核酸內(nèi)切酶在基因重組中的用途1.分割基因組DNA;12限制性核酸內(nèi)切酶在基因重組中的用途1.分割基因組DN132.獲得分子重組所必需的末端；限制性內(nèi)切酶在基因工程中的用途AABA+BB132.獲得分子重組所必需的末端；限制性內(nèi)切酶在基因工程14

定義：能催化雙鏈DNA分子中相鄰的5’-P與3’-OH之間形成磷酸二酯鍵的酶。活性：封閉缺口(nick)，不能封閉裂口(gap)。3基因重組技術(shù)

2基因重組技術(shù)的工具酶

2.2DNA連接酶（DNAligase）——分子漿糊14定義：能催化雙鏈DNA分子中相鄰的5’-P與3’-O15兩種DNA連接酶比較DNA連接酶T4DNA連接酶來源大腸桿菌大腸桿菌T4噬菌體輔助因子NAD+ATP功能缺口（nick）修補(bǔ)缺口修補(bǔ)和平頭末端連接15兩種DNA連接酶比較DNA連接酶T4DNA連接酶來源大16T4DNA連接酶在基因重組中的用途補(bǔ)缺口平頭末端連接粘性末端連接16T4DNA連接酶在基因重組中的用途補(bǔ)缺口17磷酸二酯法合成寡核苷酸磷酸三酯法合成寡核苷酸固相亞磷酸三酯法合成寡核苷酸3基因重組技術(shù)

3目的基因的分離

1基因的化學(xué)合成局限性：目前，化學(xué)合成寡核苷酸片段的能力一般局限于150～200bp以內(nèi)。然而，絕大多數(shù)基因的大小都超過了這個范圍。因此，需要一種特殊的程序，才能夠把合成的寡核苷酸片段構(gòu)建成完整的基因。17磷酸二酯法合成寡核苷酸3基因重組技術(shù)

3目的基因的分18寡核苷酸片段組裝基因的方式基因的組裝：按設(shè)計要求用許多寡核苷酸片段裝配成完整基因的過程。第一種方法是先將寡核苷酸激活，帶上必要的5’-P基團(tuán)，然后再與相應(yīng)的互補(bǔ)寡核苷酸片段退火，形成帶有粘性末端的雙鏈寡核苷酸片段。把這些雙鏈寡核苷酸片段混合在一個試管中，加上T4DNA連接酶，使它們彼此連接組成一個完整的基因或者是基因的一個片段。18寡核苷酸片段組裝基因的方式基因的組裝：按設(shè)計要求用許多寡19寡核苷酸片段組裝基因的方式第二種方法是盡可能的減少合成寡核苷酸片段的用量。將兩條具有互補(bǔ)3’末端的長的寡核苷酸片段彼此退火，所產(chǎn)生的單鏈區(qū)域以3’-OH為引物，用DNA聚合酶處理，便會合成出相應(yīng)的互補(bǔ)鏈。19寡核苷酸片段組裝基因的方式第二種方法是盡可能的減少合成寡20概念：(Genebank；Genelibrary)將一個基因組的DNA用限制酶切割成適當(dāng)大小的片段，并進(jìn)行克隆化，從而形成的含有重組DNA分子的群體。3基因重組技術(shù)

3目的基因的分離

2構(gòu)建基因文庫法20概念：(Genebank；Genelibrary)321基因文庫的構(gòu)建過程21基因文庫的構(gòu)建過程22幾個相關(guān)概念DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的生物功能主要在于復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。加熱或變性作用可以使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離，形成單鏈DNA，這稱為DNA變性（denature）。解除變性條件之后，變性的單鏈可以重新結(jié)合起來，形成雙鏈，此過程稱為DNA復(fù)性（renature），也叫退火（annealing）。變性和復(fù)性在一定條件下是完全可逆的。DNA雙鏈解離一半時的溫度叫做解鏈溫度（meltingtemperature，Tm）。3基因重組技術(shù)

3目的基因的分離

3PCR制備基因22幾個相關(guān)概念3基因重組技術(shù)

3目的基因的分離

3P233基因重組技術(shù)

3目的基因的分離

3PCR制備基因原理：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種特定區(qū)段的DNA復(fù)制，必須有DNA模板（template）、DNA聚合酶（DNApolymerase）、DNA引物（primer）、四種dNTP和Mg2＋。要擴(kuò)增模板DNA中的A～B區(qū)間的DNA片段，首先要設(shè)計兩條寡核苷酸引物，而PCR擴(kuò)增DNA的特異性和長度就由人工合成的這兩條引物決定。引物1和引物2這段DNA的序列是已知的，這是PCR擴(kuò)增的必要條件。233基因重組技術(shù)

3目的基因的分離

3PCR制備基因243基因重組技術(shù)

3目的基因的分離

3PCR制備基因步驟：PCR是通過3個溫度依賴性步驟完成的反復(fù)循環(huán)。其反應(yīng)主要分3步進(jìn)行：1.變性，即雙鏈DNA在94℃下通過熱變性使其雙鏈間氫鍵斷裂而解離成單鏈。2.退火，即當(dāng)變性溫度突然降至引物Tm值以下時，引物與模板DNA互補(bǔ)序列雜交。

延伸，即在DNA聚合酶、4種脫氧核糖核苷酸、底物及Mg2＋存在的條件下，DNA聚合酶依賴其5’→3’的聚合酶活力，以引物為起始，互補(bǔ)的DNA鏈為模板，使引物序列得以延伸，形成模板DNA的互補(bǔ)鏈。經(jīng)過高溫變性、低溫退火、中溫延伸3個溫度的循環(huán)，模板上介于兩引物之間的片斷不斷擴(kuò)展。243基因重組技術(shù)

3目的基因的分離

3PCR制備基因2525262627

載體(vector)的定義：在基因重組中，可與外源DNA片段構(gòu)成重組體，并能將重組體DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞，使外源DNA得以復(fù)制或表達(dá)的DNA分子。載體應(yīng)具備的基本特性：在宿主細(xì)胞中能獨立復(fù)制；具一段不影響其復(fù)制的非必需區(qū)域；具1~2個選擇標(biāo)記；分子量小，易操作；多拷貝；安全可靠。3基因重組技術(shù)

4基因重組技術(shù)的載體

4.1載體的定義和基本特性27載體(vector)的定義：3基因重組技術(shù)

4基因28

來源與性質(zhì)的不同質(zhì)粒載體噬菌體載體黏粒載體噬菌粒載體病毒載體人工染色體等功能和用途不同克隆載體用于DNA片段的擴(kuò)增表達(dá)載體可在寄主細(xì)胞中表達(dá)性狀穿梭質(zhì)?？赊D(zhuǎn)化兩種以上寄主細(xì)胞3基因重組技術(shù)

4基因重組技術(shù)的載體

4.2載體的種類28來源與性質(zhì)的不同3基因重組技術(shù)

4基因重組技術(shù)的載29根據(jù)受體細(xì)胞不同大腸桿菌載體酵母載體動物基因工程載體植物基因工程載體等3基因重組技術(shù)

4基因重組技術(shù)的載體

4.2載體的種類29根據(jù)受體細(xì)胞不同3基因重組技術(shù)

4基因重組技術(shù)的載體30質(zhì)粒(plasmid)的定義：質(zhì)粒是染色體外能自我復(fù)制的小型DNA分子。廣泛存在于細(xì)菌細(xì)胞中，也存在于霉菌、藍(lán)藻、酵母和少數(shù)動植物細(xì)胞中，甚至線粒體中都發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒的存在。注意：酵母的殺傷質(zhì)粒（killerplasmid）為RNA質(zhì)粒。3基因重組技術(shù)

4基因重組技術(shù)的載體

4.3質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體是基因重組中最常用的載體，主要是以細(xì)菌質(zhì)粒的各種元件為基礎(chǔ)組建而成的。它必須包含有三種共同的組成部分：復(fù)制必須區(qū)、選擇標(biāo)記基因和限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點（克隆位點）。30質(zhì)粒(plasmid)的定義：注意：酵母的殺傷質(zhì)粒（k31克隆質(zhì)粒載體專用于基因或DNA片段無性繁殖的質(zhì)粒載體。選擇標(biāo)記基因克隆位點復(fù)制必需區(qū)保證質(zhì)粒拷貝數(shù)便于插入外源DNA篩選重組子3基因重組技術(shù)

4基因重組技術(shù)的載體

4.3質(zhì)粒載體31克隆質(zhì)粒載體選擇標(biāo)記基因克隆位點復(fù)制必需區(qū)保證質(zhì)?？截悢?shù)32表達(dá)質(zhì)粒載體專用于在宿主細(xì)胞中高水平表達(dá)外源蛋白質(zhì)的質(zhì)粒載體。除了具有克隆質(zhì)粒載體的三個基本構(gòu)件外，還需要有能控制插入的外源基因進(jìn)行有效轉(zhuǎn)錄的序列以及適當(dāng)?shù)姆g調(diào)控序列。啟動子PLac來源于大腸桿菌（乳糖操縱子）、

PTrp(色氨酸操縱子)PTac（來源于Lac和Trp的雜合啟動子）強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止序列核糖體結(jié)合位點（S-D序列）、起始密碼子、終密碼止子等3基因重組技術(shù)

4基因重組技術(shù)的載體

4.3質(zhì)粒載體32表達(dá)質(zhì)粒載體專用于在宿主細(xì)胞中高水平表達(dá)外源蛋白質(zhì)的質(zhì)粒33pGEX表達(dá)質(zhì)粒載體33pGEX表達(dá)質(zhì)粒載體34酵母是一類單細(xì)胞的真核生物，作為一種真核生物表達(dá)系統(tǒng)，其優(yōu)勢在于：基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理比較清楚，遺傳操作相對簡單；具有真核生物蛋白翻譯后修飾加工系統(tǒng)；不含有特異性病毒，不產(chǎn)毒素，較為安全；發(fā)酵工藝簡單，成本低廉；能將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中。3基因重組技術(shù)

4基因重組技術(shù)的載體

4.4酵母載體34酵母是一類單細(xì)胞的真核生物，作為一種真核生物表達(dá)系統(tǒng)，其35按載體在酵母細(xì)胞中的復(fù)制形式分類酵母整合載體（yeastintegratingvector）酵母人工染色體（yeastartificialchromosome）質(zhì)粒載體酵母附加型質(zhì)粒（yeastepisomalplasmid,YEp）酵母復(fù)制質(zhì)粒（yeastreplicatingplasmid,YRp）酵母著絲粒質(zhì)粒（yeastcentromereplasmid,YCp）3基因重組技術(shù)

4基因重組技術(shù)的載體

4.4酵母載體35按載體在酵母細(xì)胞中的復(fù)制形式分類酵母整合載體（yeast363637主要由動物病毒構(gòu)建的一類載體。例如：SV40病毒載體、反轉(zhuǎn)錄病毒載體、桿狀病毒載體、痘苗病毒載體、腺病毒載體、乳頭狀病毒載體、單純皰疹病毒載體等。3基因重組技術(shù)

4基因重組技術(shù)的載體

4.5動物基因工程載體37主要由動物病毒構(gòu)建的一類載體。3基因重組技術(shù)

4基因38痘苗病毒具有線性雙鏈DNA，其轉(zhuǎn)錄和復(fù)制都在細(xì)胞質(zhì)中。痘苗病毒基因組DNA分子量大（180kb），操作起來很不方便，不適于直接用作基因克隆的載體。痘苗病毒基因組中有一HindⅢ-J片段，當(dāng)其被外源

DNA取代之后不會影響到病毒基因組的復(fù)制能力。痘苗病毒載體的特點：3基因重組技術(shù)

4基因重組技術(shù)的載體

4.5動物基因工程載體38痘苗病毒具有線性雙鏈DNA，其轉(zhuǎn)錄和復(fù)制都在細(xì)胞痘苗病毒39痘苗病毒載體39痘苗病毒載體40痘苗病毒載體40痘苗病毒載體414142

載體與外源DNA用同一種限制酶處理后得到相同的粘性末端，堿基可以配對，由T4DNA連接酶催化，進(jìn)行兩種DNA分子間的共價連接，形成重組體分子。3基因重組技術(shù)

目的基因與載體的重組42載體與外源DNA用同一種限制酶處43外源DNA質(zhì)粒酶切位點酶切酶切混合DNA連接酶利用粘性末端進(jìn)行DNA片段和載體DNA的體外重組43外源DNA質(zhì)酶切位點酶切酶切混合DNA連接酶利用粘性末端44

方法：重組體向細(xì)菌細(xì)胞的導(dǎo)入化學(xué)轉(zhuǎn)化法電擊轉(zhuǎn)化法重組體向動物細(xì)胞的導(dǎo)入病毒轉(zhuǎn)染法等3基因重組技術(shù)

5重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞轉(zhuǎn)化（transformation）轉(zhuǎn)染（transfection）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）44方法：3基因重組技術(shù)

5重組45

概念:

細(xì)菌細(xì)胞經(jīng)過一定濃度的冰凍CaCl2處理(-4℃)，便處于容易攝取各種外源DNA或噬菌體的狀態(tài)，稱為感受態(tài)（compentnt）。受體：細(xì)菌轉(zhuǎn)化效率（細(xì)菌）轉(zhuǎn)化效率為106-107轉(zhuǎn)化子/μgDNA。轉(zhuǎn)化子：導(dǎo)入外源DNA后獲得了新的遺傳標(biāo)志的細(xì)菌細(xì)胞或其它受體細(xì)胞。3基因重組技術(shù)

5重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞

5.1CaCl2感受態(tài)法——化學(xué)轉(zhuǎn)化法45概念:3基因重組技術(shù)

5重組46

概念:

將宿主細(xì)胞（或DNA受體細(xì)胞）與DNA分子置于一個高強(qiáng)電場內(nèi)，通過電場脈沖使宿主細(xì)胞發(fā)生電穿孔作用，使外源DNA分子隨即進(jìn)入的方法。受體：細(xì)菌、真核生物轉(zhuǎn)化效率（細(xì)菌）小質(zhì)粒：109轉(zhuǎn)化子/微克