分子診斷技術(shù)之PCR課件

分子診斷技術(shù)之生物技術(shù)教研室：鄭鳴分子診斷技術(shù)之生物技術(shù)教研室：鄭鳴1診斷主要通過引物介導(dǎo)特異性擴增目的基因以檢測內(nèi)源性或外源性目的基因的存在與否，進而對疾病的預(yù)防、診斷、和治療提供信息和決策依據(jù)。一診斷技術(shù)原理診斷主要通過引物介導(dǎo)特異性擴增目的基因以檢測2相關(guān)實驗開展一診斷技術(shù)原理相關(guān)實驗開展一診斷技術(shù)原理3二技術(shù)基本知識回顧技術(shù)簡史的原理二技術(shù)基本知識回顧技術(shù)簡史4技術(shù)簡史的復(fù)制核酸體外擴增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解鏈酶DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長技術(shù)簡史的復(fù)制ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACC5技術(shù)簡史的復(fù)制核酸體外擴增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5‘AUCGCG5‘引物酶引物酶RNA引物RNA引物技術(shù)簡史的復(fù)制ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACC6技術(shù)簡史的復(fù)制核酸體外擴增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’聚合酶聚合酶技術(shù)簡史的復(fù)制ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACC7技術(shù)簡史的復(fù)制核酸體外擴增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明1971年，Khorana提出：經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因。但由于測序和引物合成的困難，以及70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為可能，所以，Khorana的設(shè)想被人們遺忘了……技術(shù)簡史的復(fù)制1971年，Khorana提出：經(jīng)過DNA變性8技術(shù)簡史的復(fù)制核酸體外擴增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明1985年，美國PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）基本原理是在試管中模擬細胞內(nèi)的DNA復(fù)制最初采用E-coliDNA聚合酶進行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時，費力，且易出錯耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺PCR自動化熱循環(huán)儀1993年，Mullis等因此項技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎技術(shù)簡史的復(fù)制1985年，美國PE-Cetus公司的Mull9.<<>>年美國《》雜志列為十余項重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻年為爆炸年榮獲年度諾貝爾化學(xué)獎。只是一個簡單的不起眼玩藝?！獎P利·穆利斯（)我不認為能夠用兩種“革命”(政治革命和科學(xué)革命)加以說明。……它的發(fā)明并沒有改變基因操作的本質(zhì)。有了，我們能在更廣的范圍內(nèi)更快、更容易地進行基因操作，學(xué)術(shù)界也完全不用等到某人死去或退休后才能接受。它只不過是一種新工具?！獎P利·穆利斯（).<<>>年美國《》雜志列10生物樣品片段基因診斷基因治療基因工程產(chǎn)品法醫(yī)學(xué)檢測人類學(xué)研究……生物樣品片段基因診斷基因治療基因工程產(chǎn)品法醫(yī)學(xué)檢測人類學(xué)研究11基因組獲取特定片段擴增特定片段基因組獲取特定片段擴增特定片段12聚合酶引物引物M13噬菌體Sanger的測序技術(shù)引物DNA聚合酶聚合酶引物引物M13噬菌體Sanger的測序技術(shù)引物DNA聚13引物引物的構(gòu)思聚合酶聚合酶特定DNA片段引物引物的構(gòu)思聚合酶聚合酶特定DNA片段14℃變性℃退火℃延伸℃變性℃退火℃延伸15℃℃℃℃℃℃16聚合酶（)酶活性()溫度(℃)

聚合酶（)酶活性()溫度(℃)17℃℃℃循環(huán)℃℃℃循環(huán)18的基本原理反應(yīng)條件過程的特點標準的PCR反應(yīng)體系4種dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA

0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+

1.5mmol/L的基本原理反應(yīng)條件標準的PCR反應(yīng)體系191234522557294時間（min）溫度（℃）的基本原理反應(yīng)條件過程的特點適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)步輪目的片段擴增萬倍以上雙螺旋單鏈與引物復(fù)性變性形成條單鏈子鏈延伸加倍1234522557294時間（min）溫度（℃）的基本原理20反應(yīng)條件過程的特點的基本原理1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板95℃反應(yīng)條件的基本原理1234522557294時間（min）溫21反應(yīng)條件過程的特點的基本原理50℃引物引物DNA引物反應(yīng)條件的基本原理50℃引物引物DNA引物22反應(yīng)條件過程的特點的基本原理72℃引物引物DNA引物酶酶反應(yīng)條件的基本原理72℃引物引物DNA引物酶酶23反應(yīng)條件過程的特點的基本原理第輪結(jié)束95℃第輪開始反應(yīng)條件的基本原理第輪結(jié)束95℃第輪開始24反應(yīng)條件過程的特點的基本原理95℃50℃72℃反應(yīng)條件的基本原理95℃50℃72℃25反應(yīng)條件過程的特點的基本原理72℃第輪結(jié)束反應(yīng)條件的基本原理72℃第輪結(jié)束26的基本原理反應(yīng)條件過程的特點模板第輪擴增第輪擴增第輪擴增第輪擴增第輪擴增的基本原理反應(yīng)條件模板第輪擴增第輪擴增第輪擴增第輪擴增第輪擴27的基本原理反應(yīng)條件過程的特點靈敏度高皮克(pg=10-12)量級擴增到微克(ug=10-6)水平能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞病毒檢測的靈敏度可達3個RFU細菌檢測的最小檢出率為3個細菌特異性高引物的特異性。引物延伸時，堿基配對的正確性。TaqDNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實性。靶基因的特異性與保守性。選擇擴增特異性和保守性高的靶基因區(qū)域，擴增產(chǎn)物的特異性程度就更高。的基本原理反應(yīng)條件靈敏度高28的基本原理反應(yīng)條件過程的特點簡便、快速整個PCR的擴增在一個小小的離心管中完成，過程也只是簡單的溫度變化，耐高溫的TaqDNA聚合酶的應(yīng)用，避免了DNA聚合酶的反復(fù)加入。一次性加好反應(yīng)液，2～4小時完成擴增對標本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等組織的粗提DNA的基本原理反應(yīng)條件簡便、快速29引物設(shè)計分離核酸三反應(yīng)體系基本組份引物設(shè)計分離核酸三反應(yīng)體系基本組份30目前有兩種聚合酶供應(yīng)天然酶：從棲熱水生桿菌中提純基因工程酶：大腸菌合成一個典型的反應(yīng)約需酶量（指總反應(yīng)體積為時）濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少酶（）目前有兩種聚合酶供應(yīng)酶（）31（）的質(zhì)量與濃度和擴增效率有密切關(guān)系呈顆粒狀，保存不當(dāng)易變性失活溶液呈酸性，使用時應(yīng)配成高濃度后，以或的緩沖液將其調(diào)節(jié)到～，小量分裝，℃冰凍保存。多次凍融會使降解在反應(yīng)中，應(yīng)為～，尤其是注意種的濃度要相等（等摩爾配制），如其中任何一種濃度不同于其它幾種時（偏高或偏低），就會引起錯配。濃度過低又會降低產(chǎn)物的產(chǎn)量能與結(jié)合，使游離的濃度降低（）的質(zhì)量與濃度和擴增效率有密切關(guān)系32是聚合酶的激活劑。反應(yīng)體系。濃度過低會使酶活性喪失、產(chǎn)量下降；過高影響反應(yīng)特異性?？膳c負離子結(jié)合，所以反應(yīng)體系中、等的濃度影響反應(yīng)中游離的濃度。是聚合酶的激活劑。33引物（）引物是特異性反應(yīng)的關(guān)鍵；產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板互補的程度；理論上，只要知道任何一段模板序列，就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物，用就可將模板在體外大量擴增。引物設(shè)計是技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán)，使用不合適的引物容易導(dǎo)致實驗失?。罕憩F(xiàn)為擴增出目的帶之外的多條帶，不出帶或出帶很弱，等等。現(xiàn)在引物設(shè)計大都通過計算機軟件進行。引物（）引物是特異性反應(yīng)的關(guān)鍵；引物設(shè)計是技術(shù)中至34引物設(shè)計的基本原則引物與模板的序列要緊密互補引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體（）或發(fā)夾結(jié)構(gòu)（）引物不能在模板的非目的位點引發(fā)聚合反應(yīng)(即錯配)。引物（）引物設(shè)計的基本原則引物與模板的序列要緊密互補引物（）35具體因素引物長度（）產(chǎn)物長度（）序列值()引物與模板形成雙鏈的內(nèi)部穩(wěn)定性(,用?值反映)形成引物二聚體()及發(fā)夾結(jié)構(gòu)（）的能值在錯配位點（）的引發(fā)效率，引物及產(chǎn)物的含量（）……引物（）具體因素引物長度（）引物（）36引物的長度：一般為，常用的是，但不應(yīng)大于，因為過長會導(dǎo)致其延伸溫度大于℃，即酶的最適溫度。引物過短又同時會引起錯配現(xiàn)象，一般來說引物長度大于是必要的（不容易引起錯配）。例如：一個長度為的引物在人類基因組上存在個潛在的退火位點().而一個長度為的引物在人基因組上存在的退火位點只有個.較長的引物（)一般是用來區(qū)分同源性較高的模板序列或者使用于產(chǎn)生一些突變位點。引物（）引物設(shè)計的一般原則引物的長度：一般為，常用的是，但不應(yīng)大于，因為過長會導(dǎo)致37引物（）引物設(shè)計的一般原則引物的值引物的值一般控制在度,盡可能保證上下游引物的值一致,一般不超過～度.如果引物中的含量相對偏低,則可以使引物長度稍長,而保證一定的退火溫度.經(jīng)驗公式：()()（）:最近鄰位（）引物（）引物設(shè)計的一般原則引物的值38引物（）引物設(shè)計的一般原則引物序列的含量一般為，以％為宜，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。有一些模板本身的含量偏低或偏高，導(dǎo)致引物的含量不能在上述范圍內(nèi)，這時應(yīng)盡量使上下游引物的含量以及值保持接近（上下游引物的含量不能相差太大），以有利于退火溫度的選擇。如果比例超出，則在引物的’端增加或；而如果比例過高，則同樣在’端增加或。引物（）引物設(shè)計的一般原則引物序列的含量39引物’端的序列要比’端重要引物’端的堿基一般不用（’端堿基序列最好是、、、），因為在錯誤引發(fā)位點的引發(fā)效率相對比較高。另外引物間’端的互補、二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致反應(yīng)失敗。’端序列對影響不大，因此常用來引進修飾位點或標記物。引物（）引物設(shè)計的一般原則引物’端的序列要比’端重要引物（）引物設(shè)計的一般原則40引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高、尤其是’端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯配。引物’端出現(xiàn)個以上的連續(xù)堿基，如或，也會使錯誤引發(fā)機率增加。引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物（）引物設(shè)計的一般原則引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高、尤其是’端相似性較高的序41可能的錯誤引發(fā)位點決定于引物序列組成與模板序列組成的相似性，相似性高則錯誤引發(fā)率高。錯誤引發(fā)的引發(fā)率一般不要高過，如此可保證不出非目的產(chǎn)物的假帶。但對于特定的模板序列，還應(yīng)結(jié)合比較其在正確位點的引發(fā)效率。如果兩者相差很大，比如在正確位點的引發(fā)效率為以上，而在錯誤位點的引發(fā)效率為，并且不好找其他更合適的引物，那么這對引物也是可以接受的。引物（）引物設(shè)計的一般原則可能的錯誤引發(fā)位點決定于引物序列組成與模板序列組成的相似性，42Δ值(自由能)反映了引物與模板結(jié)合的強弱程度，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性。一般情況下，引物的Δ值最好呈正弦曲線形狀，即’端和中間Δ值較高，而’端Δ值相對較低，且不要超過（Δ值為負值，這里取絕對值），如此則有利于正確引發(fā)反應(yīng)而可防止錯誤引發(fā)。引物的’端的?值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)聚合反應(yīng)。（能值越高越容易結(jié)合）引物（）引物設(shè)計的一般原則Δ值(自由能)反映了引物與模板結(jié)合的強弱程度，該值反映了雙鏈43引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能量一般不要超過，否則容易產(chǎn)生引物二聚體帶而且會降低引物濃度從而導(dǎo)致正常反應(yīng)不能進行。與二聚體相關(guān)的一個參數(shù)是堿基的分布，’端的連續(xù)或會導(dǎo)致錯誤引發(fā)。二聚體形成的能值越高越穩(wěn)定，越不符合要求。與二聚體相同，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值越低越好。雖然有些帶有發(fā)夾環(huán)，其Δ為－的自身互補引物也可以得到不錯的結(jié)果，但是如果它的′末端被發(fā)夾環(huán)占據(jù)時就很麻煩，即會引發(fā)引物內(nèi)部的延伸反應(yīng)，減少了參與正式反應(yīng)引物的數(shù)量。當(dāng)然，如果發(fā)夾環(huán)在′末端對反應(yīng)就沒有多大的影響了。

引物（）引物設(shè)計的一般原則引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能量一般不要超過，否則容易產(chǎn)生引物二聚44（引物評價）*（自動搜索）*

（在線服務(wù)）*引物（）引物設(shè)計的常用軟件（引物評價）*引物（）引物設(shè)計的常用軟件45的使用簡介主要功能:引物設(shè)計限制性內(nèi)切酶位點分析基元()查找同源性分析的使用簡介主要功能:簡并引物設(shè)計根據(jù)氨基酸序列來設(shè)計引物引物提供了種生物遺傳密碼使用的偏好選擇、纖毛蟲大核（）、無脊椎動物線粒體（）、支原體（）、植物線粒體（）、原生動物線粒體（）、一般標準（）、脊椎動物線粒體（）、酵母線粒體（）簡并引物設(shè)計根據(jù)氨基酸序列來設(shè)計引物引物47使用介紹()啟動界面

使用介紹()啟動界面48基本信息

種密碼子偏好

基本信息49引物設(shè)計界面

引物設(shè)計界面50引物搜索選項設(shè)定引物類型搜索模式’引物位置范圍’引物位置范圍產(chǎn)物大小范圍引物長度引物搜索選項設(shè)定引物類型搜索模式’引物位置范圍’引物位置范圍51搜索結(jié)果對引物引物分值分為滿分每對引物的信息雙擊選中一對引物搜索結(jié)果對引物引物分值每對引物的信息雙擊選中一對引物52引物信息回到主窗口引物及產(chǎn)物信息是否出現(xiàn)引物信息回到主窗口引物及產(chǎn)物信息是否出現(xiàn)53一對理想的引物應(yīng)當(dāng)不存在任何一種上述結(jié)構(gòu)，因此最好的情況是最下面的分析欄都，…一對理想的引物應(yīng)當(dāng)不存在任何一種上述結(jié)構(gòu)，因此最好的情況是最54引物編輯引物編輯55引物編輯

引物編輯56用對引物評價:這是評價引物二聚體形成的，包括自身形成二聚體和引物間二聚體，形成二聚體的能值，引物‘端有無配對堿基(最好沒有)。:是看引物自身能否形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，主要也是看’端不要形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。還要看形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值，不超過。:如果模板不是基因組，而是一個特定模板序列，需要進行錯配的分析，看你的引物（尤其‘端）是否與特定模板的其他位點結(jié)合。：總結(jié)性的顯示引物位置，產(chǎn)物大小，值等參數(shù)，你可以橫向比較一下，用對引物評價:這是評價引物二聚體形成的，包括自身形成二聚體57使用說明主要功能：專門的引物設(shè)計和分析軟件使用說明主要功能：專門的引物設(shè)計和分析軟件58啟動界面

啟動界面59個彈出窗口

個彈出窗口60??61為鄰近至個堿基組成的亞單位在一個指定數(shù)據(jù)庫文件中的出現(xiàn)頻率。該頻率高則可增加錯誤引發(fā)的可能性。為鄰近至個堿基組成的亞單位在一個指定數(shù)據(jù)庫文件中的出現(xiàn)頻率。62用設(shè)計引物時的個標準值曲線以選取’到’的下降形狀有利于引物引發(fā)聚合反應(yīng)。曲線宜選用’端值相對較低的片段。Δ值在’端和中間值比較高，而在’端相對低。用設(shè)計引物時的個標準值曲線以選取’到’的下降形狀有利于引63分子診斷技術(shù)之PCR課件64選中引物上游引物下游引物只是示意圖選中引物上游引物下游引物只是示意圖65引物分析首先檢查引物二聚體尤其是’端二聚體形成的可能性。引物分析首先檢查引物二聚體尤其是’端二聚體形成的可能性。66引物分析二項檢查是發(fā)夾結(jié)構(gòu)（）；與二聚體相同，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值越低越好。引物分析二項檢查是發(fā)夾結(jié)構(gòu)（）；與二聚體相同，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值67引物分析第三項檢查為含量，以％為宜。第四檢查引物分析第三項檢查為含量，以％為宜。68引物分析

引物分析69

70

71利用進行引物評價:這是評價引物二聚體形成的，包括自身形成二聚體和引物間二聚體，主要是看引物‘端有無配對堿基(最好沒有)。形成的二聚體要看能值，能值越低越好，最好不要超過:是看引物自身能否形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，主要也是看’端不要形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。還要看形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值，不超過。如果引物中加入酶切位點，可能會有發(fā)夾結(jié)構(gòu)且能值不會太低，這就需要靈活控制退火溫度了。:分析上下游引物的堿基組成，比和值，原則我就不多說了。利用進行引物評價:這是評價引物二聚體形成的，包括自身形成二72:如果模板不是基因組，而是一個特定模板序列，需要進行錯配的分析，看你的引物（尤其‘端）是否與特定模板的其他位點結(jié)合。一般錯配的引發(fā)效率以不超過為好，但并不絕對，如果正確結(jié)合位點的引發(fā)效率為以上，而有一個錯配的引發(fā)效率是左右的，這個引物也是可以接受地！?。嚎偨Y(jié)性的顯示引物位置，產(chǎn)物大小，值等參數(shù)，你可以橫向比較一下，尤其是給了一個還是可以參照一下地。也給了簡單的評價供參考。利用進行引物評價:如果模板不是基因組，而是一個特定模板序列，需要進行錯73每條引物的濃度～或～，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。引物（）引物濃度每條引物的濃度～或～，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好引74核酸單、雙鏈均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、聚合酶抑制劑、結(jié)合蛋白類。濃度一般為，模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。一般臨床檢測標本，可采用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于擴增。模板核酸的量與純化程度，是成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。核酸單、雙鏈均可。模板核酸的量與純化程度，是成敗與否75分子診斷技術(shù)之PCR課件76分離核酸的基本步驟和原則盡可能保持其天然狀態(tài)，防止降解和變性。條件溫和，防止過酸、過堿、劇烈攪拌。抑制核酸酶。制備細胞及破碎細胞消化蛋白質(zhì),去除生物大分子去除不需要的核酸分子沉淀核酸,去除雜質(zhì)基本步驟：基本原則：分離核酸的基本步驟和原則盡可能保持其天然狀態(tài)，防止降解和變性77蛋白酶法的基本原理是一種陰離子去垢劑，在高溫（～℃）條件下能裂解細胞，使染色體離析，蛋白酶降解核蛋白，釋放出核酸；提高鹽(或)濃度并降低溫度（冰浴），使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀，離心后除去沉淀；上清液中的用酚氯仿反復(fù)抽提除去蛋白質(zhì)用無水乙醇沉淀水相中的。組份（）（）

蛋白酶終濃度

蛋白酶法提取緩沖液動物性材料的分離提純蛋白酶法蛋白酶法的基本原理是一種陰離子去垢劑，在高溫（～℃）條件下78動物組織細胞裂解上層溶液組織勻漿抽提干燥溶解離心洗滌酒精沉淀DNA溶液蛋白酶法基本流程動物性材料的分離提純蛋白酶法動物組織細胞裂解上層溶液組織勻漿抽提干燥溶解離心洗滌酒精沉淀79動物性材料的分離提純蛋白酶法蛋白酶法主要試劑組織勻漿緩沖液：

消化緩沖液：

緩沖液：

其他試劑：平衡酚:氯仿:異戊醇氯仿：異戊醇蛋白酶儲存液：儲存液：()：無水乙醇動物性材料的分離提純蛋白酶法主要試劑組織勻漿緩沖液：消化80動物性材料的分離提純蛋白酶法蛋白酶法實驗步驟樣品處理：取相應(yīng)組織～，剪碎，加入組織勻漿緩沖液，置于組織研磨器中進行研磨，形成勻漿液；取勻漿液轉(zhuǎn)入離心管，離心～，棄上清；向沉淀中加入組織勻漿緩沖液，迅速重懸后，離心～，棄上清；向沉淀中加入無菌水，迅速重懸后，再加入消化緩沖液，混勻后進行下一步操作。動物性材料的分離提純蛋白酶法實驗步驟樣品處理：81動物性材料的分離提純蛋白酶法蛋白酶法實驗步驟提取向上述懸液中加，蛋白酶（）,溫和地上下顛倒混勻～次，于～℃水浴消化～或消化過夜，其間應(yīng)不時溫和地上下顛倒混勻液體；加入酶（），℃水浴消化；向消化液中加入等體積的酚：氯仿：異戊醇，溫和地上下顛倒混勻～次，室溫放置；室溫離心～（若分層效果不好可適當(dāng)延長時間）；用寬口吸頭小心移取上清，注意不要取中間白色層；加入等體積的氯仿：異戊醇，溫和地上下顛倒混勻～次，室溫放置；室溫離心～（若分層效果不好可適當(dāng)延長時間）；動物性材料的分離提純蛋白酶法實驗步驟提取82提取用寬口吸頭小心移取上清，注意不要取中間白色層（若上清仍混濁，可再重復(fù)～抽提次）；向上清中加入體積的，溫和地充分混勻，再向溶液中加入倍體積的無水乙醇，室溫放置～或℃放置以上；室溫離心～，棄上清；向沉淀中加入～％的乙醇，溫和地上下顛倒混勻～次；室溫離心～，棄上清；將離心管輕輕在濾紙上磕幾下，以除去殘留的液體，短暫離心后用吸頭小心取出殘留液體,之后將離心管敞口室溫放置左右或在℃放置左右至無明顯的乙醇氣味即可；向沉淀中加入～的無菌水或溶液溶解樣品。動物性材料的分離提純蛋白酶法蛋白酶法實驗步驟提取動物性材料的分離提純蛋白酶法實驗步驟83法原理（，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽離子去污劑，可溶解細胞膜，并與核酸形成復(fù)合物。該復(fù)合物在高鹽溶液中（>）是可溶的，通過有機溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。注：溶液在低于℃時會形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的植物材料之前必須預(yù)熱，且離心時溫度不要低于℃。植物性材料的分離提純法法原理（，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽離子去污劑，可84

組份（）（）

β巰基乙醇終濃度

()（）使用前加入（）提供一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；螯合或離子，抑制活性；提供一個高鹽環(huán)境，使充分溶解，存在于液相中；溶解細胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離；β巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除提取緩沖液的經(jīng)典配方植物性材料的分離提純法組份（）（）β巰基乙醇終濃度85組份（）（）

β巰基乙醇終濃度

()()（）使用前加入（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少中酚的污染；同時它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖。提取緩沖液的改進配方植物性材料的分離提純法組份（）（）β巰基乙醇終濃度()86植物材料裂解液上層溶液液氮研磨抽提細胞裂解干燥溶解離心洗滌酒精沉淀DNA溶液法基本流程植物性材料的分離提純法植物材料裂解液上層溶液液氮研磨抽提細胞裂解干燥溶解離心洗滌酒87法主要試劑植物性材料的分離提純法抽提液：（)

()β巰基乙醇(用前加入)()(可以不用)緩沖液：

其他試劑：平衡酚:氯仿:異戊醇氯仿：異戊醇儲存液：()：無水乙醇法主要試劑植物性材料的分離提純抽提液：緩沖液：其他試劑：88樣品處理：取植物葉片～，剪碎，加入℃預(yù)熱的抽提液，置于組織研磨器中進行研磨，形成勻漿液，分裝離心管，每管，置℃水浴鍋中水浴裂解；或者取植物葉片～，剪碎，置于液氮預(yù)冷的研缽中，加入適量液氮，輕輕研磨至粉末（注意不要使粉末解凍，其間可反復(fù)添加液氮），將粉末轉(zhuǎn)入離心管，加入℃預(yù)熱的抽提液，置℃水浴鍋中水浴裂解；注意：水浴期間應(yīng)不時上下顛倒混勻，動作要輕柔，以免斷裂。法實驗步驟植物性材料的分離提純法樣品處理：法實驗步驟植物性材料的分離提純89提取向消化中加入酶（），℃水浴消化；向消化液中加入等體積的酚：氯仿：異戊醇，溫和地上下顛倒混勻～次，室溫放置；室溫離心～（若分層效果不好可適當(dāng)延長時間）；用寬口吸頭小心移取上清，注意不要取中間白色層；加入等體積的氯仿：異戊醇，溫和地上下顛倒混勻～次，室溫放置；室溫離心～（若分層效果不好可適當(dāng)延長時間）；法主要試劑植物性材料的分離提純法提取法主要試劑植物性材料的分離提純90提取用寬口吸頭小心移取上清，注意不要取中間白色層（若上清仍混濁，可再重復(fù)～抽提次）；向上清中加入體積的，溫和地充分混勻，再向溶液中加入倍體積的無水乙醇，室溫放置～或℃放置以上；室溫離心～，棄上清；向％的乙醇，溫和地上下顛倒混勻～次；室溫沉淀中加入～離心～，棄上清；將離心管輕輕在濾紙上磕幾下，以除去殘留的液體，短暫離心后用吸頭小心取出殘留液體,之后將離心管敞口室溫放置左右或在℃放置左右至無明顯的乙醇氣味即可；向沉淀中加入～的無菌水或溶液溶解樣品。法主要試劑植物性材料的分離提純法提取法主要試劑植物性材料的分離提純91I.材料準備II.破碎細胞或包膜－內(nèi)容物釋放III.核酸分離、純化IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)

V.核酸溶解在適量緩沖液或水中基因組的提取注意事項基本步驟：I.材料準備基因組的提取注意事項基本步驟：92.材料準備最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融提取血液基因組時，要選擇有核細胞（白細胞）組培細胞培養(yǎng)時間不能過長，否則會造成降解含病毒的液體材料含量較少，提取前先富集.材料準備最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融93材料應(yīng)適量，過多會影響裂解，導(dǎo)致量少，純度低針對不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式：植物材料－－液氮研磨動物組織－－勻漿或液氮研磨組培細胞－－蛋白酶細菌－－溶菌酶破壁酵母－－破壁酶或玻璃珠高溫溫浴時，定時輕柔振蕩.破碎細胞或包膜材料應(yīng)適量，過多會影響裂解，導(dǎo)致量少，純度低.破碎細胞或包膜94采用吸附材料吸附的方式分離時，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系采用有機（酚氯仿）抽提時應(yīng)充分混勻，但動作要輕柔離心分離兩相時，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時間針對不同材料的特點，在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法.核酸分離、純化采用吸附材料吸附的方式分離時，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系.核酸分離95蛋白質(zhì)的去除：酚氯仿抽提使用變性劑變性（、異硫氰酸胍等）高鹽洗滌蛋白酶處理.核酸分離、純化蛋白質(zhì)的去除：.核酸分離、純化96多糖的去除：高鹽法：用乙醇沉淀時，在待沉淀溶液中加入體積的，高鹽可溶解多糖。用多糖水解酶將多糖降解。在提取緩沖液中加一定量的氯苯(體積)，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖。用代替乙醇沉淀：在μ液中加入μ(含)，冰浴。.核酸分離、純化多糖的去除：.核酸分離、純化97多酚的去除：在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：β巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等加入易與酚類結(jié)合的試劑：如、(聚乙二醇)，它們與酚類有較強的親和力，可防止酚類與的結(jié)合鹽離子的去除：％的乙醇洗滌.核酸分離、純化多酚的去除：鹽離子的去除：.核酸分離、純化98當(dāng)沉淀時間有限時，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會更充分沉淀時加入體積的（，），有利于充分沉淀沉淀后應(yīng)用％的乙醇洗滌，以除去鹽離子等晾干，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥）若長期儲存建議使用緩沖液溶解中的能螯和或離子，抑制值為，可防止發(fā)生酸解.核酸的沉淀、溶解當(dāng)沉淀時間有限時，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會更充分.核99中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)；在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)；中殘留有金屬離子。重新純化，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)（具體方法見前）重新沉淀，讓酒精充分揮發(fā)增加％乙醇洗滌的次數(shù)（次）問題一：樣品不純，抑制后續(xù)酶解和反應(yīng)。原因?qū)Σ呋蚪M的常見問題中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)；重新純化，去除蛋白、多糖、多酚100材料不新鮮或反復(fù)凍融；未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性；提取過程操作過于劇烈，被機械打斷；外源核酸酶污染；反復(fù)凍融。盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融；液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液；在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的時，可增加裂解液中螯合劑的含量；細胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔；所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌；將分裝保存于緩沖液中，避免反復(fù)凍融。問題二：降解。對策原因基因組的常見問題材料不新鮮或反復(fù)凍融；盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍101實驗材料不佳或量少；破壁或裂解不充分；沉淀不完全；洗滌時丟失。盡量選用新鮮（幼嫩）的材料；動植物要勻漿研磨充分；＋菌、酵母裂解前先用生物酶或機械方式破壁；高溫裂解時，時間適當(dāng)延長（對于動物細胞、細菌可增加的用量）；低溫沉淀，延長沉淀時間；加輔助物，促進沉淀；洗滌時，最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒。問題三：提取量少。對策原因基因組的常見問題實驗材料不佳或量少；盡量選用新鮮（幼嫩）的材料；問題三：提取102細胞在變性劑異硫氰酸胍的作用下被裂解，同時核蛋白體上的蛋白變性，核酸釋放；釋放出來的和由于在特定下因溶解度的不同而分別位于整個體系中的中間相和水相，從而得以分離；有機溶劑抽提，沉淀，得到純凈。的分離提純異硫氰酸胍苯酚法異硫氰酸胍苯酚法的基本原理細胞在變性劑異硫氰酸胍的作用下被裂解，同時核蛋白體上的蛋白變103的分離提純異硫氰酸胍苯酚法異硫氰酸胍苯酚法的基本流程動物組織細胞裂解上層溶液組織勻漿抽提干燥溶解離心洗滌異丙醇沉淀RNA溶液植物材料液氮研磨的分離提純異硫氰酸胍苯酚法的基本流程動物組織細胞裂解上層溶104的分離提純異硫氰酸胍苯酚法異硫氰酸胍苯酚法主要試劑細胞裂解液：異硫氰酸胍檸檬酸鈉十二烷基肌氨酸鈉β巰基乙醇(用前加入)其他試劑：水平衡酚:氯仿:異戊醇()：

乙醇異丙醇水法提取試劑：購買不同廠家的試劑其他試劑：氯仿

乙醇異丙醇水

的分離提純異硫氰酸胍苯酚法主要試劑細胞裂解液：法提取105的分離提純異硫氰酸胍苯酚法異硫氰酸胍苯酚法實驗步驟樣品處理：取新鮮組織，剪碎，置于組織勻漿器中，加入加入預(yù)冷的細胞裂解液，充分研磨形成勻漿液，室溫放置后分裝不同的離心管，每管；的抽提加入醋酸鈉（）μ，充分混勻。加入酚：氯仿：異戊醇，充分混勻搖振，冰浴℃，離心；移取上層水相至另一離心管中，加入等體積的異丙醇，室溫靜置，沉淀；的分離提純異硫氰酸胍苯酚法實驗步驟樣品處理：106的分離提純異硫氰酸胍苯酚法異硫氰酸胍苯酚法實驗步驟的抽提℃，離心.棄上清液，加入乙醇，洗滌沉淀物；℃，離心。棄上清液，自然干燥，但應(yīng)避免沉淀完全干燥，否則難以溶解加入μ水重懸，或加無水乙醇和體積醋酸鈉（），℃保存。的分離提純異硫氰酸胍苯酚法實驗步驟的抽提107I.材料準備II.破碎細胞或包膜－內(nèi)容物釋放III.核酸分離、純化IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)

V.核酸溶解在適量緩沖液或水中的提取注意事項基本步驟：I.材料準備的提取注意事項基本步驟：108.材料準備新鮮，切忌使用反復(fù)凍融的材料；如若材料來源困難，且實驗需要一定的時間間隔。可以先將材料貯存在或樣品貯存液中，于℃或℃保存；如要多次提取，請分成多份保存；液氮長期保存，－℃短期保存。.材料準備新鮮，切忌使用反復(fù)凍融的材料；109.破碎細胞或包膜根據(jù)不同材料選擇不同的處理方法：培養(yǎng)細胞：通?？芍苯蛹恿呀庖毫呀饨湍负图毦阂话憧芍苯恿呀?，對于一些特殊的材料可先用酶或者機械方法破壁動植物組織：先液氮研磨和勻漿，后加裂解液裂解。期間動作快速，樣品保持冷凍樣品量適當(dāng)，保證充分裂解；為減少污染，可適當(dāng)加大裂解液的用量。.破碎細胞或包膜根據(jù)不同材料選擇不同的處理方法：110.核酸分離、純化在使用氯仿抽提純化時，一定要充分混勻，且動作快速；經(jīng)典的純化方法，如沉淀等，雖然經(jīng)濟，但操作時間長，易造成降解；柱離心式純化方法：抽提速度快，能有效去除影響后續(xù)酶反應(yīng)的雜質(zhì)，是目前較為理想的選擇。.核酸分離、純化在使用氯仿抽提純化時，一定要充分混勻，且動作111當(dāng)沉淀時間有限時，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會更充分；沉淀后應(yīng)用％的乙醇洗滌，以除去鹽離子等；晾干，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥）；若長期儲存，建議在無水乙醇和體積醋酸鈉（）溶液中，℃保存。.核酸的沉淀、溶解當(dāng)沉淀時間有限時，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會更充分；.112樣品不新鮮；裂解不充分；外源污染。取新鮮細胞或組織，盡量避免樣品反復(fù)凍融，盡量在低溫條件下處理樣品；檢查裂解液的質(zhì)量是否合格，適當(dāng)增加裂解液用量，延長裂解時間；嚴格處理實驗中所需的各種耗材和試劑。問題一：的降解。原因?qū)Σ叻蛛x的常見問題樣品不新鮮；取新鮮細胞或組織，盡量避免樣品反復(fù)凍融，盡量在低113蛋白質(zhì)污染；酚類污染；抽提試劑殘留。不要吸入中間層及有機相，加入氯仿后首先混勻，并且離心分層的離心力和時間要足夠；減少起始樣品量，確保裂解完全、徹底；重新抽提一次，再沉淀，溶解；確保洗滌時要徹底懸浮，并且徹底去掉乙醇。問題二：比值偏低。原因?qū)Σ叻蛛x的常見問題蛋白質(zhì)污染；不要吸入中間層及有機相，加入氯仿后首先混勻，并且114降解；抽提試劑殘留；污染。操作時注意防止降解；確保洗滌時要徹底懸浮，并且徹底去掉乙醇；使用的消化抽提的。問題三：下游實驗效果不佳。原因?qū)Σ叻蛛x的常見問題降解；操作時注意防止降解；問題三：下游實驗效果不佳。原因115四反應(yīng)條件設(shè)置溫度時間循環(huán)次數(shù)四反應(yīng)條件設(shè)置溫度116溫度與時間的設(shè)置設(shè)置變性退火延伸三個溫度點。標準反應(yīng)中采用三溫度點法，雙鏈在～℃變性，再迅速冷卻至～℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至～℃，在聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因（長度為～時）可采用二溫度點法，將退火與延伸溫度合二為一，一般采用℃變性，℃左右退火與延伸。溫度與時間的設(shè)置設(shè)置變性退火延伸三個溫度點。117溫度與時間的設(shè)置變性溫度與時間變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致失敗的最主要原因一般℃～℃足以使模板變性若低于℃則需延長時間但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或產(chǎn)物完全變性，就