微生物發(fā)酵制藥技術(shù)基礎(chǔ)-培養(yǎng)基和設(shè)備的滅菌

項(xiàng)目二培養(yǎng)基和設(shè)備的滅菌單元二微生物發(fā)酵制藥技術(shù)基礎(chǔ)任務(wù)二培養(yǎng)基滅菌的原理在發(fā)酵工業(yè)中，對(duì)培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備的滅菌，廣泛使用濕熱滅菌法。當(dāng)培養(yǎng)基被加熱滅菌時(shí)，常會(huì)出現(xiàn)這樣的矛盾：加熱時(shí)，微生物固然會(huì)被殺死，但培養(yǎng)基中的有用成分也會(huì)隨之遭到破壞。因此，必須選擇一個(gè)既能滿(mǎn)足滅菌需要，又可使培養(yǎng)基的破壞盡可能少的滅菌工藝條件。致死溫度：殺死微生物的極限溫度。致死時(shí)間：在致死溫度下，殺死全部微生物需要的時(shí)間。熱阻：對(duì)熱的抵抗力，指微生物在某一特定條件（主要是溫度和加熱方式）下的致死時(shí)間。相對(duì)熱阻：微生物對(duì)熱的相對(duì)抵抗能力。指微生物在某一特定條件下的致死時(shí)間與另一微生物在相同條件下的致死時(shí)間的比值。（一）微生物的熱阻N—?dú)埓娴幕罹鷶?shù)；t—滅菌時(shí)間（s）；K—滅菌速率常數(shù)（s-1），或比死亡速率常數(shù)，此常數(shù)的大小與微生物的種類(lèi)與加熱溫度有關(guān)；dN/dt—活菌數(shù)瞬時(shí)變化速率，即死亡速率。（二）對(duì)數(shù)殘留定律

1.滅菌時(shí)間的確定

微生物受熱死亡的主要原因是高熱能使蛋白質(zhì)變性，這種反應(yīng)可認(rèn)為是單分子反應(yīng)，死亡速率可視為一級(jí)反應(yīng)。

微生物的死亡速率與任一瞬時(shí)殘存的活菌數(shù)成正比。滅菌時(shí)間的確定：對(duì)數(shù)殘留定律

t取決于污染程度N0滅菌的程度Ns：Ns=0，t→∞；工程設(shè)計(jì)常用Ns=10-3個(gè)/mL，也就是每處理1000批培養(yǎng)基只允許殘留一個(gè)活的微生物或1000次滅菌操作中有一次失敗。

只有相對(duì)無(wú)菌，沒(méi)有絕對(duì)無(wú)菌。滅菌速率常數(shù)k：是微生物耐熱性的特征，k的大小與微生物的種類(lèi)和滅菌溫度有關(guān)。

2.死亡速率常數(shù)k

滅菌速率常數(shù)k是判斷微生物受熱死亡難易程度的基本依據(jù)，隨微生物種類(lèi)和滅菌溫度而異。同一溫度下，不同微生物的k值不同，k值愈小，微生物愈耐熱。同一種微生物，滅菌溫度越低，k值越??；滅菌溫度越高，k值越大。因此，提高滅菌溫度，k值增大，滅菌時(shí)間t顯著縮短。A---頻率常數(shù)，也稱(chēng)阿累尼烏斯常數(shù)，s-1；R---氣體常數(shù)，8.314J/mol·K；T---絕對(duì)溫度，K；ΔE---微生物死亡活化能，J/mol?；蚺囵B(yǎng)基成分分解所需活化能K—滅菌速率常數(shù)（s-1），或培養(yǎng)基內(nèi)易被破壞成分的分解速率常數(shù)微生物的受熱死亡及培養(yǎng)基受熱破壞都屬于單分子反應(yīng)，符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，兩個(gè)方程中的速率常數(shù)K與溫度之間的關(guān)系可用阿累尼烏斯公式表示：從上式可知，K值的大小與微生物或營(yíng)養(yǎng)成分的種類(lèi)與加熱溫度有關(guān)3.滅菌溫度的選擇溫度為T(mén)1時(shí)，（2-9）溫度為T(mén)2時(shí)，

（2-10）上述兩式相除后，取對(duì)數(shù)得（2-11）培養(yǎng)基滅菌時(shí)，當(dāng)加熱溫度由T1升至T2時(shí)，微生物的死亡速率常數(shù)k的變化情況為：對(duì)培養(yǎng)基成分的破壞而言，同樣有：（2-12）滅菌時(shí)殺死微生物的活化能大于培養(yǎng)基成分的破壞活化能能，因此：

即隨著溫度的上升，微生物的死亡速率常數(shù)增加倍數(shù)要大于培養(yǎng)基成分破壞速率的增加倍數(shù)。從上述的分析可知，在熱滅菌過(guò)程中，同時(shí)會(huì)發(fā)生微生物死亡和培養(yǎng)基破壞這兩種過(guò)程。溫度升高，菌體死亡速率大于培養(yǎng)基成分破壞的速率。滅菌溫度（℃）滅菌時(shí)間（min）維生素B1的破壞量（%）1001101201301451504003640.50.080.0199.367.027.08.02.0＜1.0不同滅菌溫度、時(shí)間與培養(yǎng)基成分破壞情況（Ns/No=10-3）滅菌溫度越高，培養(yǎng)基達(dá)到完全滅菌所需時(shí)間越短，營(yíng)養(yǎng)成分的破壞量也越少。提高滅菌溫度，縮短滅菌時(shí)間，可達(dá)到相同的滅菌效果，并有利于減少培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的破壞。因此發(fā)酵培養(yǎng)基通常采用高溫短時(shí)的滅菌方法。滅菌要達(dá)到殺死99.99%的細(xì)菌芽孢，有兩種方法可以采用，一種是118℃滅菌15min，另一種是128℃滅菌5min。哪一種方法好，為什么？問(wèn)題（三）影響滅菌的因素污染雜菌的種類(lèi)、數(shù)量滅菌溫度、時(shí)間（三）影響滅菌的因素培養(yǎng)基成分、物理狀態(tài)脂肪、糖分和蛋白質(zhì)等有機(jī)物增加微生物細(xì)胞的耐熱性，高濃度鹽類(lèi)、色素等的存在會(huì)削弱微生物細(xì)胞的耐熱性。固體培養(yǎng)基滅菌時(shí)間要比液體培養(yǎng)基滅菌時(shí)間長(zhǎng)。培養(yǎng)基的pH值pH值6.0～8.0，微生物最耐熱；培養(yǎng)基的pH值愈低，滅菌所需時(shí)間愈短培養(yǎng)基中微生物數(shù)量微生物數(shù)量越多，達(dá)到滅菌效果所需的時(shí)間愈長(zhǎng)微生物細(xì)胞含水量、菌齡

微生物細(xì)胞所含水分越多，則蛋白質(zhì)凝固溫度越低，微生物細(xì)胞愈易受熱而喪失生命力。年老細(xì)胞含水量低，對(duì)不良環(huán)境的抵抗能力比年輕細(xì)胞強(qiáng)。微生物的耐熱性

芽孢＞孢子＞營(yíng)養(yǎng)體空氣排出情況攪拌、泡沫

實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)防止突然減少進(jìn)汽或加大排汽，減少進(jìn)排汽不平衡，防止泡沫的大量生成，同時(shí)對(duì)極易發(fā)泡的培養(yǎng)基應(yīng)加少量消泡劑減少泡沫量。項(xiàng)目二培養(yǎng)基和設(shè)備的滅菌單元二微生物發(fā)酵制藥技術(shù)基礎(chǔ)任務(wù)三培養(yǎng)基滅菌方法（一）分批滅菌分批滅菌：分批滅菌就是將配制好的培養(yǎng)基全部輸入到發(fā)酵罐內(nèi)或其他裝置中，通入蒸汽將培養(yǎng)基和所用設(shè)備一起加熱至滅菌溫度后維持一定時(shí)間，再冷卻到接種溫度，也稱(chēng)為間歇滅菌，實(shí)罐滅菌或?qū)嵪?，是中小型發(fā)酵罐通常采用的一種培養(yǎng)基滅菌方法。分為三個(gè)階段：升溫、保溫和冷卻。實(shí)罐滅菌是典型的分批滅菌。全過(guò)程包括升溫、保溫、降溫三個(gè)過(guò)程

培養(yǎng)基的配制及輸送：在配制罐中按照培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基后，通過(guò)專(zhuān)用管道輸入發(fā)酵罐中。滅菌前準(zhǔn)備工作：開(kāi)始滅菌時(shí)，將發(fā)酵罐的空氣分過(guò)濾器進(jìn)行滅菌，用壓縮空氣將分過(guò)濾器吹干，保壓。放去夾套或蛇管中的冷卻水，開(kāi)啟排氣管閥。1.操作方法加熱（1）預(yù)熱開(kāi)啟攪拌，在夾套或蛇管中通入蒸汽進(jìn)行間接加熱，培養(yǎng)基的溫度達(dá)到90℃左右時(shí)，停止攪拌，關(guān)閉夾套蒸汽閥門(mén)。預(yù)熱的目的防止直接導(dǎo)入蒸汽時(shí)由于培養(yǎng)基與蒸汽的溫度過(guò)大而產(chǎn)生大量的冷凝水使培養(yǎng)基稀釋防止直接導(dǎo)入蒸汽所造成的泡沫急劇上升而引起的物料外溢。1.操作方法（2）三路進(jìn)汽從空氣管、取樣管、放料管蒸汽旁通閥門(mén)向罐內(nèi)直接通入蒸汽，排氣管冒出大量蒸汽后，打開(kāi)接種、補(bǔ)料、消泡劑、酸堿等管道閥門(mén)，調(diào)節(jié)好各排汽和進(jìn)汽閥門(mén)的開(kāi)度，使培養(yǎng)基溫度達(dá)到120℃，1×105pa。三路進(jìn)汽：蒸汽直接從空氣管、取樣管、放料管蒸汽旁通閥門(mén)進(jìn)入罐內(nèi)直接加熱圖2-4分批滅菌設(shè)備示意圖保溫：調(diào)節(jié)好各進(jìn)汽和排汽閥門(mén)開(kāi)度，使罐壓和溫度保持在120℃、1×105pa。凡進(jìn)口在培養(yǎng)基液面下的各管道（空氣、取樣、排料）都應(yīng)通入蒸汽，在液面上的各管道（接種、補(bǔ)料、消泡劑、酸堿補(bǔ)料等）則應(yīng)排放蒸汽，保證滅菌徹底，不留死角。1.操作方法冷卻：先關(guān)閉發(fā)酵罐頂部各路進(jìn)料管道上的閥門(mén)，然后依次關(guān)閉放料管路、通風(fēng)管路、取樣管路上的閥門(mén)。保持罐頂?shù)呐艢忾y排蒸汽，使壓力降低至0.05MPa時(shí)，打開(kāi)通風(fēng)管路上各空氣閥，進(jìn)無(wú)菌空氣保壓，一般調(diào)節(jié)罐壓在0.1MPa左右。

再在夾套或蛇管中通入冷水，培養(yǎng)基溫度降至70-80℃后，開(kāi)攪拌，繼續(xù)降溫。使培養(yǎng)基溫度降到所需要的溫度。1.操作方法需注意問(wèn)題配制的培養(yǎng)基體積應(yīng)準(zhǔn)確培養(yǎng)基滅菌前，要對(duì)發(fā)酵罐進(jìn)行空消，對(duì)pH、DO傳感電極進(jìn)行校正夾套內(nèi)可通入蒸汽對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行間接加熱（預(yù)熱），也可通入冷卻水使培養(yǎng)基降溫，這兩個(gè)過(guò)程均需進(jìn)行攪拌，但必須在70-80℃下才能攪拌。在加熱和保溫過(guò)程中應(yīng)使所有與發(fā)酵罐相連的管道中都有蒸汽通過(guò)，不留死角。加熱和保溫過(guò)程中，防止突然開(kāi)大或關(guān)小進(jìn)汽、排汽閥門(mén)，避免大量泡沫產(chǎn)生。冷卻階段，注意保壓，防止二次污染3.培養(yǎng)基分批滅菌的優(yōu)點(diǎn)設(shè)備要求低，不需另外設(shè)置加熱冷卻裝置；操作要求低，適于手動(dòng)操作；適合于小批量生產(chǎn)規(guī)模；適合于含大量固體物質(zhì)的培養(yǎng)基滅菌。4.培養(yǎng)基分批滅菌的缺點(diǎn)培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)損失較多，滅菌后培養(yǎng)基質(zhì)量下降；需反復(fù)進(jìn)行加熱和冷卻，能耗較高；不適合于大規(guī)模生產(chǎn)過(guò)程的滅菌；加熱和冷卻所需時(shí)間較長(zhǎng)，增加了發(fā)酵的準(zhǔn)備時(shí)間，就相應(yīng)地延長(zhǎng)了發(fā)酵周期，使發(fā)酵罐得利用率降低。（二）連續(xù)滅菌將配制好的培養(yǎng)基通過(guò)專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)的滅菌器，進(jìn)行連續(xù)流動(dòng)滅菌后，進(jìn)入預(yù)先滅菌過(guò)的發(fā)酵罐中的滅菌方式，也稱(chēng)為連消。

依設(shè)備和工藝條件的不同，連續(xù)滅菌分：連消塔加熱的連續(xù)滅菌流程噴射加熱器加熱的連續(xù)滅菌流程薄板換熱器加熱的連續(xù)滅菌流程1.連消塔加熱的連續(xù)滅菌流程這是國(guó)內(nèi)味精廠普遍采用的連續(xù)滅菌流程。培養(yǎng)基用泵打入連消塔與蒸汽直接混合，在連消塔內(nèi)的停留時(shí)間為20～30s，達(dá)到滅菌溫度132℃。再送入維持罐保溫，時(shí)間8～25min，最后由噴淋冷卻器冷卻至后續(xù)的發(fā)酵或培養(yǎng)溫度。

缺點(diǎn)：設(shè)備較龐大；維持罐直徑較大，不能保證物料先進(jìn)先出，易發(fā)生局部過(guò)熱或滅菌不足的現(xiàn)象；噴淋冷卻管道很長(zhǎng)，對(duì)于黏度較高、固形物含量較多的培養(yǎng)基極易堵塞。2.噴射加熱器加熱的連續(xù)滅菌流程優(yōu)點(diǎn)：能保證培養(yǎng)液在噴射加熱器和維持管中的先進(jìn)先出，避免了培養(yǎng)基過(guò)熱和滅菌不徹底現(xiàn)象，培養(yǎng)基總的受熱時(shí)間短，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失不嚴(yán)重。缺點(diǎn)：真空冷卻系統(tǒng)要求嚴(yán)格密封，以免重新污染。3.薄板換熱器加熱的連續(xù)滅菌流程

薄板換熱器由于具有設(shè)備緊湊、占地面少、拆洗方便、傳熱面積和傳熱系數(shù)高、不使熱敏物料產(chǎn)生局部過(guò)熱現(xiàn)象等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于食品、發(fā)酵、制藥、化工部門(mén)作為加熱、冷卻或滅菌之用。采用板式換熱器的連續(xù)滅菌流程，生培養(yǎng)液進(jìn)入板式換熱器的熱回收與熟培養(yǎng)液先進(jìn)行一次熱交換達(dá)到預(yù)熱，以便提高熱量的利用率，然后進(jìn)入加熱階段到滅菌溫度后引入維持器進(jìn)行保溫，滅菌好的熟培養(yǎng)液再進(jìn)入熱回收段作為生培養(yǎng)液的加熱介質(zhì)，同時(shí)本身也得到一定程度的冷卻，最后進(jìn)入冷卻階段用冷卻水冷卻到所需培養(yǎng)溫度。板式換熱器的特點(diǎn)是：培養(yǎng)基在設(shè)備中同時(shí)完成預(yù)熱、滅菌及冷卻過(guò)程。雖然加熱和冷卻生培養(yǎng)液所需時(shí)間比使用噴射式連續(xù)滅菌較長(zhǎng)，但滅菌周期比分批滅菌小得多。由于生培養(yǎng)基的預(yù)熱過(guò)程即滅菌培養(yǎng)基的冷卻過(guò)程，所以節(jié)約了蒸汽及冷卻水的用量，板式換熱器的缺點(diǎn)是制造加工復(fù)雜，必須有專(zhuān)業(yè)廠成批生產(chǎn)，密封要求高，密封填圈易損壞，需經(jīng)常調(diào)換。連續(xù)滅菌的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)短時(shí)間內(nèi)加熱到保溫溫度且能快速冷卻，減少養(yǎng)分的損失操作條件恒定，滅菌質(zhì)量穩(wěn)定易于實(shí)行管道化和自動(dòng)化控制避免反復(fù)加熱和冷卻，提高了熱利用率發(fā)酵設(shè)備利用率高缺點(diǎn)設(shè)備要求高，需另外設(shè)置加熱冷卻裝置操作比較麻煩染菌機(jī)會(huì)多對(duì)蒸汽要求高不適合大量固體物料的滅菌注意問(wèn)題連續(xù)滅菌前發(fā)酵罐應(yīng)進(jìn)行空消連續(xù)滅菌流程中使用的加熱器、維持器、冷卻器等應(yīng)先進(jìn)行清洗和滅菌培養(yǎng)基滅菌前應(yīng)先預(yù)熱耐熱性物料和不耐熱性物料可在不同溫度下分消項(xiàng)目二培養(yǎng)基和設(shè)備的滅菌單元二微生物發(fā)酵制藥技術(shù)基礎(chǔ)任務(wù)四設(shè)備和管道的滅菌種子罐、發(fā)酵罐、計(jì)量罐、補(bǔ)料罐等空罐滅菌

從各罐底部的有關(guān)管道通入蒸汽，使罐內(nèi)壓力達(dá)0.147MPa，維持45min。滅菌完畢，關(guān)閉蒸汽閥后，待罐內(nèi)壓力低于空氣過(guò)濾器壓力時(shí)通入滅菌空氣保壓至0.098MPa?？諝饪傔^(guò)濾器和分過(guò)濾器滅菌

從空氣過(guò)濾器上部通入蒸汽，并從上、下排氣口排氣，維持壓力0.147MPa，滅菌2h。滅菌完畢，通入壓縮空氣將空氣過(guò)濾器吹干，然后保壓。補(bǔ)料管路，消沫劑管路滅菌

可與補(bǔ)料罐、消沫劑罐同時(shí)進(jìn)行滅菌，但保溫時(shí)間為1h。接種管路滅菌一般要求蒸汽壓力0.3～0.45MPa，保溫1h。項(xiàng)目二培養(yǎng)基和設(shè)備的滅菌單元二微生物發(fā)酵制藥技術(shù)基礎(chǔ)任務(wù)五其他物料和實(shí)驗(yàn)用具的滅菌條件滅菌鍋滅菌條件：固體培養(yǎng)基0.098MPa，20-30min；液體培養(yǎng)基0.098MPa，15-20min；玻璃器皿及用具0.098MPa，30-60min種子培養(yǎng)基實(shí)罐滅菌條件：121℃，30min消泡劑滅菌條件：121℃，30min尿素溶液滅菌條件：105℃，5min補(bǔ)料實(shí)罐滅菌條件：淀粉液121℃，5min

糖液120℃，30min項(xiàng)目二培養(yǎng)基和設(shè)備的滅菌單元二微生物發(fā)酵制藥技術(shù)基礎(chǔ)任務(wù)一滅菌的方法培養(yǎng)基滅菌的定義是指從培養(yǎng)基中殺滅有生活能力的細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)體及其孢子，或從中將其除去。工業(yè)規(guī)模的液體培養(yǎng)基滅菌，殺滅雜菌比除去雜菌更為常用。熱滅菌法(干熱、濕熱和火焰滅菌法)射線滅菌法臭氧滅菌法化學(xué)試劑滅菌法過(guò)濾除菌法(阻留微生物，達(dá)到除菌的目的)

（一）干熱滅菌法

160℃，1-2h。使微生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)發(fā)生氧化作用而死亡。用于玻璃和金屬器皿的滅菌。（二）濕熱滅菌法濕熱滅菌法：利用飽和蒸汽滅菌。使微生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)發(fā)生凝固作用而致死。由于蒸汽有很強(qiáng)的穿透力，冷凝時(shí)放出大量的潛熱，來(lái)源方便，價(jià)格低廉，滅菌效果好，是目前最基本的適合培養(yǎng)基和設(shè)備的滅菌方法。一般條件為：121℃，30min。用于生產(chǎn)設(shè)備、培養(yǎng)基、管道、閥門(mén)、流加物料等的滅菌。（三）射線滅菌法原理：利用高能電子波、紫外線或放射性物質(zhì)產(chǎn)生的高能粒子，可以穿透微生物細(xì)胞而達(dá)到滅菌的方法。常用的射線有：宇宙線（0.0001～0.1?）、γ射線、x射線、紫外線、高速電子流的陰極射線等。適用范圍有限，只用于無(wú)菌室、無(wú)菌箱等局部空間和器皿等的表面消毒。（四）化學(xué)試劑滅菌法消毒劑用途常用濃度使用方法1