《種子的擴(kuò)大培養(yǎng)》課件

發(fā)酵工程精品課程/jpkc/fjgc發(fā)酵工程精品課程http://biotech.ecust.e1第四章種子的擴(kuò)大培養(yǎng)種子擴(kuò)大培養(yǎng)的目的與要求種子制備實(shí)例種子制備的技術(shù)概要種子的擴(kuò)大培養(yǎng)/jpkc/fjgc第四章種子的擴(kuò)大培養(yǎng)種子擴(kuò)大培養(yǎng)的目的與要求種子制備實(shí)例種2

種子擴(kuò)大培養(yǎng)是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級擴(kuò)大培養(yǎng),最終獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。第一節(jié)種子擴(kuò)大培養(yǎng)的目的與要求種子擴(kuò)大培養(yǎng)的概念:種子的擴(kuò)大培養(yǎng)種子擴(kuò)大培養(yǎng)的目的與要求/jpkc/fjgc種子擴(kuò)大培養(yǎng)是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中3種子擴(kuò)培的目的接種量的需要菌種的馴化縮短發(fā)酵時間、保證生產(chǎn)水平種子的要求：總量及濃度能滿足要求生理狀況穩(wěn)定，個體與群體活力強(qiáng)，移種至發(fā)酵后，能夠迅速生長無雜菌污染種子的擴(kuò)大培養(yǎng)種子擴(kuò)大培養(yǎng)的目的與要求/jpkc/fjgc種子擴(kuò)培的目的接種量的需要菌種的馴化縮短發(fā)酵時間4第一節(jié)種子制備過程舉例一、谷氨酸生產(chǎn)的種子制備制備過程斜面菌種→一級種子培養(yǎng)→二級種子培養(yǎng)→發(fā)酵種子的擴(kuò)大培養(yǎng)種子擴(kuò)大培養(yǎng)的目的與要求/jpkc/fjgc第一節(jié)種子制備過程舉例一、谷氨酸生產(chǎn)的種子制備制備過程斜面51、斜面(AS1.299)培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏1%，氯化鈉0.5瓊脂2%，pH7.0-7.2培養(yǎng)基特點(diǎn)：有利于菌體的生長，原料比較精細(xì)培養(yǎng)條件：32℃，生長18-24小時生長斜面要求：生長良好，所使用斜面連續(xù)傳代不超過3次種子的擴(kuò)大培養(yǎng)種子擴(kuò)大培養(yǎng)的目的與要求/jpkc/fjgc1、斜面(AS1.299)培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏1%62.一級種子（搖瓶）培養(yǎng)條件：于1000ml三角瓶中，裝液200-250ml,32℃培養(yǎng)12小時。培養(yǎng)基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米漿2.5%，K2HPO40.1%培養(yǎng)基特點(diǎn)：有利于菌體的生長，所使用的原料已經(jīng)基本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基種子的擴(kuò)大培養(yǎng)種子擴(kuò)大培養(yǎng)的目的與要求/jpkc/fjgc2.一級種子（搖瓶）培養(yǎng)條件：于1000ml三角瓶中，裝液73.二級種子(種子罐)培養(yǎng)條件：在種子罐中培養(yǎng)（容積為發(fā)酵罐的1%(10%)），32℃培養(yǎng)7-10個小時培養(yǎng)基：和一級種子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，濃度為2.5%培養(yǎng)基的特點(diǎn)：長菌體，更接近于發(fā)酵培養(yǎng)基種子的擴(kuò)大培養(yǎng)種子擴(kuò)大培養(yǎng)的目的與要求/jpkc/fjgc3.二級種子(種子罐)培養(yǎng)條件：在種子罐中培養(yǎng)（容積為發(fā)8種子的質(zhì)量要求：108-109個/ml大小均勻，呈單個或八字排列PH7.0-7.2時結(jié)束，6.8→8→7.0-7.2活力旺盛種子的擴(kuò)大培養(yǎng)種子擴(kuò)大培養(yǎng)的目的與要求/jpkc/fjgc種子的質(zhì)量要求：108-109個/ml種子的擴(kuò)大培養(yǎng)種子擴(kuò)大9二、青霉素生產(chǎn)的種子制備制備過程安培管→斜面孢子→大米孢子→一級種子→二級種子→發(fā)酵種子的擴(kuò)大培養(yǎng)種子擴(kuò)大培養(yǎng)的目的與要求/jpkc/fjgc二、青霉素生產(chǎn)的種子制備制備過程安培管→斜面孢子→大10一、斜面孢子培養(yǎng)基：甘油、葡萄糖、蛋白胨等培養(yǎng)基特點(diǎn)：有利于長孢子，用量少而精細(xì)培養(yǎng)條件：25℃、7天,注意濕度50%左右種子的擴(kuò)大培養(yǎng)種子擴(kuò)大培養(yǎng)的目的與要求/jpkc/fjgc一、斜面孢子培養(yǎng)基：甘油、葡萄糖、蛋白胨等培養(yǎng)基特點(diǎn)：有11二、大米孢子培養(yǎng)基：大米及氮源（玉米漿）培養(yǎng)基的特點(diǎn)：成本低、米粒之間結(jié)構(gòu)疏松提高比表面積和氧的傳質(zhì)，營養(yǎng)適當(dāng)（要求大米的白點(diǎn)?。┯欣阪咦拥纳L。培養(yǎng)條件：25℃、7天，控制濕度大米孢子的要求：1粒米含1.4*106個孢子種子的擴(kuò)大培養(yǎng)種子擴(kuò)大培養(yǎng)的目的與要求/jpkc/fjgc二、大米孢子培養(yǎng)基：大米及氮源（玉米漿）培養(yǎng)基的特點(diǎn)：成本低123、一級種子培養(yǎng)基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米漿目的：長菌體培養(yǎng)條件：27℃，40小時接種量：200億孢子/噸4、二級種子培養(yǎng)基：同上培養(yǎng)條件：27℃、10-14小時接種量：10%種子的擴(kuò)大培養(yǎng)種子擴(kuò)大培養(yǎng)的目的與要求/jpkc/fjgc3、一級種子培養(yǎng)基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米漿目的：長菌13種子的質(zhì)量要求菌絲長稠呈絲狀、菌絲團(tuán)很少，有中小空孢，處于Ⅲ—Ⅳ期青霉素發(fā)酵菌絲體的生長共分為6個期，1-4為年青期，4-6期合成青霉素的能力最強(qiáng)種子的擴(kuò)大培養(yǎng)種子擴(kuò)大培養(yǎng)的目的與要求/jpkc/fjgc種子的質(zhì)量要求菌絲長稠呈絲狀、菌絲團(tuán)很少，有中小空孢，處于Ⅲ14第二節(jié)種子制備的技術(shù)概要一、種子制備的過程實(shí)驗室階段：不用種子罐，所用的設(shè)備為培養(yǎng)箱、搖床等實(shí)驗室常見設(shè)備，在工廠這些培養(yǎng)過程一般都在菌種室完成，因此現(xiàn)象地將這些培養(yǎng)過程稱為實(shí)驗室階段的種子培養(yǎng)。生產(chǎn)車間階段：種子培養(yǎng)在種子罐里面進(jìn)行，一般在工程歸為發(fā)酵車間管理，因此形象地稱這些培養(yǎng)過程為生產(chǎn)車間階段。種子的擴(kuò)大培養(yǎng)種子制備的技術(shù)概要/jpkc/fjgc第二節(jié)種子制備的技術(shù)概要一、種子制備的過程實(shí)驗室階段：不用15二、實(shí)驗室階段1、培養(yǎng)物選擇的原則目的：種子擴(kuò)培到一定的量和質(zhì)，根據(jù)菌種的特點(diǎn)最終的培養(yǎng)物可分為兩類：

對于不產(chǎn)孢子和芽孢的微生物——獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體對于不產(chǎn)芽孢和孢子的微生物，實(shí)驗室階段的種子擴(kuò)培最終是獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體，如谷氨酸的種子培養(yǎng)。種子的擴(kuò)大培養(yǎng)種子制備的技術(shù)概要/jpkc/fjgc二、實(shí)驗室階段1、培養(yǎng)物選擇的原則目的：種子擴(kuò)培到一定的量和16獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的孢子菌絲體培養(yǎng)步驟少，因而更容易獲得量和質(zhì)穩(wěn)定的種子，但操作繁瑣。對于產(chǎn)孢子的微生物獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌絲體便于操作，但需要更仔細(xì)的控制。種子的擴(kuò)大培養(yǎng)種子制備的技術(shù)概要/jpkc/fjgc獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的孢子菌絲體培養(yǎng)步驟少，因而更容易獲得172、培養(yǎng)基選擇的原則培養(yǎng)基的選擇應(yīng)該是有利于菌體的生長，對孢子培養(yǎng)基應(yīng)該是有利于孢子的生長。在原料方面，實(shí)驗室種子培養(yǎng)階段，規(guī)模一般比較小，因此為了保證培養(yǎng)基的質(zhì)量，培養(yǎng)基的原料一般都比較精細(xì)。種子的擴(kuò)大培養(yǎng)種子制備的技術(shù)概要/jpkc/fjgc2、培養(yǎng)基選擇的原則培養(yǎng)基的選擇應(yīng)該是有利于菌體的生長，對孢183、起始接種物的傳代問題

細(xì)菌保藏斜面→活化斜面產(chǎn)孢子保藏→母斜面→子斜面目的：使菌種的傳代次數(shù)盡可能的少。種子的擴(kuò)大培養(yǎng)種子制備的技術(shù)概要/jpkc/fjgc3、起始接種物的傳代問題細(xì)菌保藏斜面→活化斜面19三、生產(chǎn)車間階段1、培養(yǎng)物的選擇原則在生產(chǎn)車間階段，最終一般都是獲得一定數(shù)量的菌絲體?？s短發(fā)酵時間有利于獲得好的發(fā)酵結(jié)果菌絲體比孢子要有利：種子的擴(kuò)大培養(yǎng)種子制備的技術(shù)概要/jpkc/fjgc三、生產(chǎn)車間階段1、培養(yǎng)物的選擇原則在生產(chǎn)車間階段，最終一般202、培養(yǎng)基選擇的原則目的：獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體，因此培養(yǎng)基的選擇應(yīng)首先考慮的是有利于孢子的發(fā)育和菌體的生長，所以營養(yǎng)要比發(fā)酵培養(yǎng)基豐富。在原料方面：不如實(shí)驗室階段那么精細(xì)，而是基本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基，這有兩個方面的原因:

一是成本二是馴化種子的擴(kuò)大培養(yǎng)種子制備的技術(shù)概要/jpkc/fjgc2、培養(yǎng)基選擇的原則目的：獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體，因此培養(yǎng)21例：檸檬酸發(fā)酵以蔗糖為原料成分斜面種子罐發(fā)酵麥芽汁麥汁蔗糖2.5-5%20%NH4NO30.225%0.11%K2HPO40.03%MgSO4.H2O0.025%0.025%KCl0.015%瓊脂2%種子的擴(kuò)大培養(yǎng)種子制備的技術(shù)概要/jpkc/fjgc例：檸檬酸發(fā)酵以蔗糖為原料成分22

薯干粉成分斜面種子罐發(fā)酵麥芽汁麥汁薯干粉10%22-28%(NH4)2SO40.5%瓊脂2%種子的擴(kuò)大培養(yǎng)種子制備的技術(shù)概要/jpkc/fjgc薯干粉成分斜面233、發(fā)酵級數(shù)的確定谷氨酸：三級發(fā)酵一級種子（搖瓶）→二級種子（小罐）→發(fā)酵青霉素：三級發(fā)酵一級種子（小罐）→二級種子（中罐）→發(fā)酵

一般由菌絲體培養(yǎng)開始計算發(fā)酵級數(shù)，但有時，工廠從第一級種子罐開始計算發(fā)酵級數(shù)種子的擴(kuò)大培養(yǎng)種子制備的技術(shù)概要/jpkc/fjgc3、發(fā)酵級數(shù)的確定谷氨酸：三級發(fā)酵一級種子（搖瓶）→二級種子24發(fā)酵級數(shù)確定的依據(jù)級數(shù)受發(fā)酵規(guī)模、菌體生長特性、接種量的影響

級數(shù)大，難控制、易染菌、易變異，管理困難，一般2-4級。

在發(fā)酵產(chǎn)品的放大中，反應(yīng)級數(shù)的確定是非常重要的一個方面種子的擴(kuò)大培養(yǎng)種子制備的技術(shù)概要/jpkc/fjgc發(fā)酵級數(shù)確定的依據(jù)級數(shù)受發(fā)酵規(guī)模、菌體生長特性、接種量的25采用三級種子的谷氨酸發(fā)酵工藝

李文東，發(fā)酵科技通訊，2003,7斜面→一級種子（1200ml/5000ml三角瓶）→二級種子（2m3）→三級種子（20m3)→發(fā)酵（240m3)背景：二級種子小種量（種子罐是發(fā)酵罐的1%左右）二級種子大種量（種子罐是發(fā)酵罐的5%以上）文章：三級種子工藝種子的擴(kuò)大培養(yǎng)種子制備的技術(shù)概要/jpkc/fjgc采用三級種子的谷氨酸發(fā)酵工藝斜面→一級種子（1200ml/526用途成分（%）規(guī)模保藏牛肉膏（英國）1，蛋白胨（日本），瓊脂粉（日本）1.8，無機(jī)鹽斜面添加0.1的口服葡萄糖，其余同上一級口服葡萄糖3，玉米漿2.4，尿素0.65，無機(jī)鹽等1200ml/5000ml二級玉米淀粉雙酶糖2.0，玉米漿2.0，甘蔗糖蜜1.0,尿素0.35，無機(jī)鹽等1.2/2m3三級玉米淀粉雙酶糖4.0，玉米漿1.5，甘蔗糖蜜1.0,液氨，復(fù)合維生素01mg/L，無機(jī)鹽等12/20m3發(fā)酵玉米淀粉雙酶糖13-14，玉米漿0.06-0.08，甘蔗糖蜜1.0,液氨，維生素50g，無機(jī)鹽等154/240m3培養(yǎng)基成分表種子的擴(kuò)大培養(yǎng)種子制備的技術(shù)概要/jpkc/fjgc用途成分（%）規(guī)模保藏牛肉膏（英國）1，蛋白胨（日本），27三級種子的特點(diǎn)：①種量更大，生長速度快：工藝8小時產(chǎn)酸（%）12小時產(chǎn)酸（%）發(fā)酵周期（h)三級種子2.2～2.74.6～5.232二級種子1.0～1.52.6～3.435②糖酸轉(zhuǎn)化率高且穩(wěn)定工藝產(chǎn)酸（%）糖酸轉(zhuǎn)化率（%）單罐產(chǎn)量(噸）三級種子10.9359.821二級種子9.85818種子的擴(kuò)大培養(yǎng)種子制備的技術(shù)概要/jpkc/fjgc三級種子的特點(diǎn)：工藝8小時產(chǎn)酸（%）12小時產(chǎn)酸（%）發(fā)酵周284、接種量的確定移入種子的體積接種量＝—————————接種后培養(yǎng)液的體積過大過小都不好，最終以實(shí)踐定，如大多數(shù)抗生素為7-15%。但是一般認(rèn)為大一點(diǎn)好。雙種：兩個種子罐接種到一個發(fā)酵罐中。倒種：一部分種子來源于種子罐，一部分來源于發(fā)酵罐。

種子的擴(kuò)大培養(yǎng)種子制備的技術(shù)概要/jpkc/fjgc4、接種量的確定移入種子的29接種量對菌體形態(tài)和產(chǎn)Υ亞麻酸的影響楊博，中國油脂，2002

Υ亞麻酸是一種人體必需多價不飽和脂肪酸，它是人體前列腺素的前體物質(zhì)，在預(yù)防與治療心腦血管疾病、糖尿病治療、增強(qiáng)免疫力、抗癌和保護(hù)皮膚等方面具有重要的生理功能。因發(fā)酵法生產(chǎn)Υ亞麻酸與從天然植物提取相比具有一系列優(yōu)點(diǎn)，發(fā)酵法生產(chǎn)Υ亞麻酸成了當(dāng)今研究的一個熱點(diǎn)。

Υ亞麻酸發(fā)酵一般是采用絲狀真菌來進(jìn)行，絲狀真菌的形態(tài)往往對發(fā)酵有較明顯的影響，而絲狀真菌發(fā)酵Υ亞麻酸時菌絲體形態(tài)的不同對發(fā)酵的影響很少有報道。

種子的擴(kuò)大培養(yǎng)種子制備的技術(shù)概要/jpkc/fjgc接種量對菌體形態(tài)和產(chǎn)Υ亞麻酸的影響Υ亞麻酸是一種人體必30采用被孢霉進(jìn)行Υ亞麻酸發(fā)酵時接種量可以明顯影響菌絲體種子的擴(kuò)大培養(yǎng)種子制備的技術(shù)概要/jpkc/fjgc采用被孢霉進(jìn)行Υ亞麻酸發(fā)酵時接種量可以明顯影響菌絲體種子的擴(kuò)31本研究發(fā)現(xiàn)，采用被孢霉進(jìn)行Υ亞麻酸發(fā)酵時接種量可以明顯影響菌絲體的形態(tài)，從而影響菌體干重和Υ亞麻酸產(chǎn)量。種子的擴(kuò)大培養(yǎng)種子制備的技術(shù)概要/jpkc/fjgc本研究發(fā)現(xiàn)，采用被孢霉進(jìn)行Υ亞麻酸發(fā)酵時接種量可以明顯影響菌32種子的擴(kuò)大培養(yǎng)種子制備的技術(shù)概要/jpkc/fjgc種子的擴(kuò)大培養(yǎng)種子制備的技術(shù)概要http://biotech33不同接種量影響菌體的生長和發(fā)酵種子的擴(kuò)大培養(yǎng)種子制備的技術(shù)概要/jpkc/fjgc不同接種量影響菌體的生長和發(fā)酵種子的擴(kuò)大培養(yǎng)種子制備的技術(shù)34發(fā)酵前期發(fā)酵液作為種子，發(fā)酵指數(shù)明顯提高發(fā)酵后期菌體自溶明顯，影響提煉收率種子的擴(kuò)大培養(yǎng)種子制備的技術(shù)概要/jpkc/fjgc發(fā)酵前期發(fā)酵液作為種子，發(fā)酵