培養(yǎng)基配制技術(shù)-培養(yǎng)基的制備

培養(yǎng)基的概念

培養(yǎng)基是指人工配制并滅菌的，適合微生物生長(zhǎng)繁殖或生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的，用于微生物培養(yǎng)、分離、鑒別、研究和保存的混合營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。因此，培養(yǎng)基必須具備微生物所需要的碳、氮、磷、硫等大量元素及微量元素、生長(zhǎng)因子及水等，保持一定的參透壓，維持適合pH值，呈現(xiàn)適當(dāng)?shù)奈锢砗蜔o(wú)菌狀態(tài)。

培養(yǎng)基分類：按成分劃分

（1）天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基含有各種天然物質(zhì)，其成分及含量不確定，如蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏、玉米漿、麥芽浸膏等

（2）合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基是由已知化學(xué)成分的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)組成的。由于微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求的不同，它可以完全由無(wú)機(jī)鹽或無(wú)機(jī)鹽加有機(jī)化合物組成。（3）半合成培養(yǎng)基由部分天然材料和部分化學(xué)藥品組成的培養(yǎng)基稱為半合成培養(yǎng)基。由于多數(shù)微生物均能在此類培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，配制方便，成本低廉，所以生產(chǎn)或?qū)嶒?yàn)中經(jīng)常用半合成培養(yǎng)基。按物理狀態(tài)劃分

（1）液體培養(yǎng)基用各種材料的抽提物或化學(xué)試劑按照一定比例配成的水溶液或液體狀態(tài)的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)叫液體培養(yǎng)基，微生物在液體培養(yǎng)基中靜止生長(zhǎng)時(shí)，需氧微生物往往可在液面形成膜、島、環(huán)，而液體仍清晰透明；厭氧或兼性厭氧微生物生長(zhǎng)而導(dǎo)致液體混濁或有沉淀。

（2）固體培養(yǎng)基除了用固體物料加水或營(yíng)養(yǎng)鹽構(gòu)成的疏松固體培養(yǎng)基（如曲、固體酶制劑、醬）外，固體培養(yǎng)基主要是指在液體培養(yǎng)基中加入一定量的固化膠體物質(zhì)而配制成的胨狀培養(yǎng)基。將微生物細(xì)胞接種到固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能形成一定特征的菌落或菌苔。固體培養(yǎng)基對(duì)于研究微生物的分離、純化、培養(yǎng)、保存、鑒定等均是不可缺少的。

按用途劃分

（1）.基礎(chǔ)培養(yǎng)基是含有一般微生物生長(zhǎng)繁殖所需的基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基?；A(chǔ)培養(yǎng)基也可以作為一些特殊培養(yǎng)基的基礎(chǔ)成分，再根據(jù)某種微生物的特殊營(yíng)養(yǎng)需求，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而制成特殊培養(yǎng)基。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是最常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

（2）富集培養(yǎng)基也稱營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入某些特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)制成的一類營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，這些特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包括血液、血清、酵母浸膏、動(dòng)植物組織液等。富集培養(yǎng)基常用于營(yíng)養(yǎng)要求苛刻的異養(yǎng)微生物的培養(yǎng)。

（3）鑒別培養(yǎng)基在培養(yǎng)基中加入某種特殊化學(xué)物質(zhì)，某種微生物在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)后能產(chǎn)生某種代謝產(chǎn)物，而這種代謝產(chǎn)物可以與培養(yǎng)基中的特殊化學(xué)物質(zhì)發(fā)生特定的化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生明顯的特征性變化，根據(jù)這種特征性變化，可將該種微生物與其他微生物區(qū)分開來(lái)。

（4）選擇培養(yǎng)基是用來(lái)將某種或某類微生物從混雜的微生物群體中分離出來(lái)的培養(yǎng)基。根據(jù)不同種類微生物的特殊營(yíng)養(yǎng)需求或?qū)δ撤N化學(xué)物質(zhì)的敏感性不同，在培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或化學(xué)物質(zhì)，抑制不需要的微生物的生長(zhǎng)，有利于所需微生物的生長(zhǎng)。配制培養(yǎng)基的基本原則

一、根據(jù)微生物的營(yíng)養(yǎng)特點(diǎn)選擇營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)

微生物營(yíng)養(yǎng)類型不同對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求不同，因此依據(jù)不同微生物的營(yíng)養(yǎng)要求配制適宜的培養(yǎng)基是配制培養(yǎng)基的基本原則之一。

自養(yǎng)型微生物能從簡(jiǎn)單的無(wú)機(jī)物合成自身的有機(jī)體，因此培養(yǎng)自養(yǎng)型微生物的培養(yǎng)基可以由簡(jiǎn)單的無(wú)機(jī)物組成。例如氧化硫硫桿菌培養(yǎng)基組成中，只有CO2、(NH4)2SO4、MgSO4、FeSO4、KH2PO4、CaCL2、S和水等無(wú)機(jī)物，沒有加入任何有機(jī)化合物。多數(shù)藻類也是自養(yǎng)型微生物，它們的培養(yǎng)基組成也比較簡(jiǎn)單，只需要無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而不需要有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。但是培養(yǎng)異養(yǎng)型微生物的培養(yǎng)基需要添加無(wú)機(jī)物和有機(jī)物，而且不同類型的異養(yǎng)型微生物的營(yíng)養(yǎng)要求差異很大。如培養(yǎng)大腸桿菌的培養(yǎng)基組成簡(jiǎn)單，而培養(yǎng)腸膜明串珠菌的培養(yǎng)基成分非常復(fù)雜，僅生長(zhǎng)因子多達(dá)33種。原生動(dòng)物也是異養(yǎng)型微生物，需要較多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如梨形四膜蟲的培養(yǎng)基含有10種氨基酸、7種維生素、鳥嘌呤、尿嘧啶及一些無(wú)機(jī)鹽等。二、控制營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度和比例

營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度過(guò)低不能滿足微生物正常生長(zhǎng)所需，太高則可能對(duì)微生物產(chǎn)生毒害，如高濃度的無(wú)機(jī)鹽、重金屬離子等會(huì)抑菌或殺菌。因此，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)合適的濃度是微生物生長(zhǎng)發(fā)育的必要條件之一。在生產(chǎn)過(guò)程中，在不影響微生物的生理特性和代謝轉(zhuǎn)化率的情況下，通常趨向在較高濃度下進(jìn)行生產(chǎn)，以提高產(chǎn)物產(chǎn)量，并盡可能選育高滲透壓的生產(chǎn)菌株。當(dāng)然，培養(yǎng)基濃度太大會(huì)使培養(yǎng)基黏度增加和溶氧量降低。

營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之間應(yīng)有適當(dāng)?shù)谋壤?，尤其培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的碳氮比(C／N)在微生物培養(yǎng)中尤其重要。不同菌種、不同發(fā)酵產(chǎn)物所要求的碳氮比是不同的。菌體在不同生長(zhǎng)階段，對(duì)其碳氮比的要求也不一樣。氮源過(guò)多，則菌體繁殖旺盛，pH值偏高，不利于代謝產(chǎn)物的積累；氮源不足，則菌體繁殖量少，從而影響產(chǎn)量。碳源過(guò)多，則容易形成較低的pH值；碳源不足，菌體衰老和自溶。三、控制酸堿度

各種微生物正常生長(zhǎng)均有合適的pH值，一般霉菌和酵母菌比較適于微酸性環(huán)境，放線菌和細(xì)菌適于中性或微堿性環(huán)境。為此，當(dāng)培養(yǎng)基配制好后，若pH值不合適，必須加以調(diào)節(jié)。

四、控制氧化還原電位

不同微生物對(duì)氧化還原電位的要求不同，一般地，好氧型微生物氧化還原電位值大于+0.1V，最適值是+0.3～+0.4V，厭氧型微生物氧化還原電位值小于+0.1V。氧化還原電位的高低受氧氣分壓、pH值和微生物代謝產(chǎn)物的影響。通常增加通氣量或加入氧化劑，可以增加氧化還原電位值，加入還原劑如抗壞血酸、硫化氫、谷胱甘肽等可降低氧化還原電位值。

五、就地取材

在大規(guī)模生產(chǎn)中培養(yǎng)基用量很大，在選用培養(yǎng)基原料時(shí)應(yīng)就地取材，盡量地利用當(dāng)?shù)剌^豐富的廉價(jià)原料，設(shè)法降低成本。例如，賴氨酸生產(chǎn)中先選用山芋淀粉，后改為用山芋粉為碳源，這樣不僅價(jià)廉，而且山芋粉中還含有生物素、鎂鹽等，省去了原來(lái)所加的玉米漿、硫酸鎂，并使整個(gè)成本降低15％。六、滅菌處理

培養(yǎng)基混有環(huán)境中各種雜菌，必須對(duì)培養(yǎng)基滅菌才能避免外來(lái)雜菌的干擾。對(duì)培養(yǎng)基滅菌一般采用高壓蒸汽滅菌法，在121℃下維持15～30分鐘即可達(dá)到滅菌目的。

在高壓蒸汽滅菌過(guò)程中，長(zhǎng)時(shí)間高溫會(huì)使不耐熱的糖類遭到破壞，形成氨基糖、焦糖。因此含糖培養(yǎng)基常在112℃下進(jìn)行滅菌或過(guò)濾除菌后再與已滅菌的成分混合使用。長(zhǎng)時(shí)間高溫還引起磷酸鹽、碳酸鹽與某些陽(yáng)離子結(jié)合，形成難溶性復(fù)合物，因此，常在培養(yǎng)基中加入少量螯合劑（如EDTA）或?qū)l(fā)生反應(yīng)的物質(zhì)分開滅菌后混合都可以避免產(chǎn)生沉淀。培養(yǎng)基中泡沫的存在也對(duì)滅菌極為不利，應(yīng)在培養(yǎng)基中加入消泡劑，減少或避免泡沫的產(chǎn)生謝謝高氏一號(hào)培養(yǎng)基配方

可溶性淀粉20g，KNO31g，K2HPO4·3H2O0.5g，MgSO4·7H2O0.5g，NaCL0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.01g，瓊脂20g，水1000ml，pH=7.4～7.6。制備流程及注意事項(xiàng)

1、稱量和溶化按配方和培養(yǎng)基需用量計(jì)算并稱取可溶性淀粉，放入小燒杯中，并用少量冷水將淀粉調(diào)成糊狀，再加入少于所需水量的沸水中，繼續(xù)加熱，使可溶性淀粉完全溶化。然后再稱取其他各成分，并依次溶化，對(duì)微量成分FeSO4·7H2O可先配成0.01g/mL的貯備液，按比例換算后再加入。待所有試劑完全溶解后，補(bǔ)充水分到所需的總體積。配制固體培養(yǎng)基時(shí)，將稱好的瓊脂放入已溶解的試劑中，再加熱融化，最后補(bǔ)足水分。2、調(diào)pH用試紙測(cè)培養(yǎng)基的原始pH,如果偏酸，用滴管向培養(yǎng)基中加入1mol/LNaOH,邊滴邊攪拌，并隨時(shí)用pH試紙測(cè)其pH,直至pH達(dá)7.6。反之，用1mol/LHCL進(jìn)行調(diào)節(jié)。

3、分裝和加塞將配制好的培養(yǎng)基分裝入試管內(nèi)，剩余的培養(yǎng)基裝入三角瓶中，在試管口或錐形瓶口上塞上棉塞。4、包扎加塞后，將全部試管用麻繩捆好，再在棉塞外包一層牛皮紙，其外再用一根麻繩扎好。用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、配制日期。

5、滅菌將上述培養(yǎng)基放入高壓滅菌鍋，以121℃,0.103MPa高壓蒸汽滅菌20～30min。

6、擱置斜面將滅菌的試管培養(yǎng)基冷卻至50℃左右，將試管口端擱在玻璃棒上。斜面的斜度要適當(dāng)，使斜面的長(zhǎng)度約為管長(zhǎng)1/3～1/2。

7、無(wú)菌檢查將滅菌培養(yǎng)基放入37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～28h，以檢查滅菌是否徹底，如果無(wú)菌生長(zhǎng)即為滅菌完全。

謝謝牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方：

牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCL5.0g，瓊脂15～20g，水1000ml，pH7.4～7.6。其中牛肉膏提供碳源、能源、磷酸鹽和維生素，蛋白胨提供氮源和維生素，而NaCL提供無(wú)機(jī)鹽，在配制固體培養(yǎng)基時(shí)需要加入一定量瓊脂作凝固劑，如果配制液體培養(yǎng)基則不用加入瓊脂。制備步驟及注意事項(xiàng)

1.稱量（假定配制1000ml培養(yǎng)基）

依據(jù)培養(yǎng)基配方及所需培養(yǎng)基總量，計(jì)算并準(zhǔn)確地稱取牛肉膏、蛋白胨、NaCL各自的量,放入燒杯（或鋼鍋）中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在稱量紙上，稱量后直接放人水中，稍微加熱，牛肉膏便會(huì)與稱量紙分離，然后立即取出紙片。蛋白胨很容易吸濕，在稱取時(shí)動(dòng)作要迅速。稱量時(shí)嚴(yán)防藥品混雜，如果用同一把角匙取用不同藥品時(shí)，稱取一種藥品后，將角匙洗凈擦干，再稱量另一藥品，同時(shí)瓶蓋也不要蓋錯(cuò)。2.溶化

在燒杯（鋼鍋）中先加入所需要的水量，用玻棒攪勻，然后，在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解，將藥品完全溶解后，補(bǔ)充水到所需的總體積；如果配制固體培養(yǎng)基時(shí)，將稱好的瓊脂放人已溶的藥品中，再加熱溶化，最后補(bǔ)足所需水分。在瓊脂溶化過(guò)程中，應(yīng)控制火力，以免培養(yǎng)基因沸騰而溢出容器，同時(shí)，不斷攪拌，以防瓊脂糊底燒焦。通常不用銅或鐵鍋加熱溶化，以免離子進(jìn)入培養(yǎng)基中，影響細(xì)菌生長(zhǎng)。3.調(diào)pH

在未調(diào)pH前，先用精密pH試紙測(cè)量培養(yǎng)基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培養(yǎng)基中逐滴加入1mol／LNaOH，邊加邊攪拌，并隨時(shí)用pH試紙測(cè)其pH，直至pH達(dá)7.4～7.6。反之，用1mol／LHCl進(jìn)行調(diào)節(jié)。對(duì)于要求pH較精確的培養(yǎng)基，其pH的調(diào)節(jié)常用酸度計(jì)進(jìn)行。pH調(diào)節(jié)不要過(guò)頭，以避免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各物質(zhì)的濃度。

4.過(guò)濾

趁熱用多層紗布過(guò)濾，除去雜質(zhì)，以利實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察。不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，可以省去過(guò)濾，本實(shí)驗(yàn)不需過(guò)濾。5.分裝

液體培養(yǎng)基分裝高度以試管高度的1／4左右為宜，固體培養(yǎng)基不超過(guò)管高的1／5，半固體培養(yǎng)基以試管高度的1／3為宜。分裝三角瓶的雖則根據(jù)需要而定，一般以不超過(guò)三角瓶容積的一半為宜。有的液體培養(yǎng)基在滅菌后，需要補(bǔ)加一定量的其他無(wú)菌成分，如抗生素等，則裝量一定要準(zhǔn)確。分裝過(guò)程中，注意不要使培養(yǎng)基沾在管(瓶)口上，以免沾污棉塞而引起污染（6.加塞

培養(yǎng)基分裝完畢后，在試管口或三角瓶口上塞上棉塞(或硅膠塞、金屬或高溫塑料試管帽等)，以阻止外界微生物進(jìn)入培養(yǎng)基內(nèi)面造成污染，并保證有良好的通氣性能。制作棉塞時(shí)，選用大小薄厚適中的普通棉花一塊，鋪展在左手拇指和食指形成的圓孔上，用右手食指將棉花從中央壓入圓孔中制成棉塞，直接壓入試管或三角瓶口。制成的棉塞要求不緊不松，兩頭光滑，試管棉塞的長(zhǎng)度約3cm左右，塞入后，試管內(nèi)部分約占2/3，管外頭部占1/3左右7.包扎

試管加塞后，以10多支為一組，在棉塞外包一層牛皮紙包扎成捆（圖4-8），注明培養(yǎng)基名稱、配制日期、配制人備用。三角燒瓶加塞后，外包牛皮紙，用麻繩以活結(jié)形式扎好，同樣用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱、配制日期、配制人備用。8.滅菌

將包扎好的培養(yǎng)基按照配方中規(guī)定的條件及時(shí)滅菌。普通培養(yǎng)基在l21℃下高壓蒸氣滅菌20min即可達(dá)到滅菌效果。

9.擺斜面

將滅菌的試管培養(yǎng)基冷至50℃左右(以防斜面上冷凝水太多)，將試管口端擱在玻棒或其他合適高度的器具上，擱置的斜面長(zhǎng)度以不超過(guò)試管總長(zhǎng)的一半為宜。10.無(wú)菌檢查

將滅菌培養(yǎng)基放入37℃的恒溫箱中培養(yǎng)24～48h，檢查確實(shí)無(wú)菌生長(zhǎng)方可使用。謝謝PDA培養(yǎng)基配方：

馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂15～20克、自來(lái)水1000毫升、自然pH。1、稱量和熬煮按培養(yǎng)基配方及制備量稱取洗凈去皮土豆適量，切成小塊放入鍋中，加入所需水量，加熱至沸騰，維持20～30min，用2層紗布趁熱過(guò)濾，濾渣棄取。濾液補(bǔ)足所需水分備用。

2、加熱溶解把濾液放入鍋中，加入所需葡萄糖、瓊脂，然后放在石棉網(wǎng)上，小火加熱，并用玻棒不斷攪拌，以防瓊脂糊底或溢出，待瓊脂完全溶解后，再補(bǔ)充水分至所需量。3、分裝按實(shí)訓(xùn)要求，將配制的培養(yǎng)基分裝入試管或500ml三角瓶?jī)?nèi)。分裝時(shí)可用漏斗以免使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上造成污染。分裝量：固體培養(yǎng)基約為試管高度的1/5，滅菌后制成斜面，分裝入三角瓶?jī)?nèi)以不超過(guò)其容積的一半為宜；半固體培養(yǎng)基以試管高度的1/3為宜，滅菌后垂直待凝。4、加棉塞培養(yǎng)基分裝完畢后，在試管口或三角燒瓶口上塞上棉塞(或泡沫塑料塞或試管帽等)，以阻止外界微生物進(jìn)入培養(yǎng)基內(nèi)造成污染，并保證