微生物數(shù)量檢驗技術(shù)-計數(shù)方法的驗證

項目八微生物數(shù)量檢查技術(shù)任務4計數(shù)方法的驗證技能點3更年寧微生物總數(shù)檢查方法驗證3更年寧微生物總數(shù)檢查方法驗證3.1實訓目的了解供試品特性及其微生物總數(shù)限度標準。熟悉微生物總數(shù)檢查方法驗證用菌液的制備方法。掌握方法驗證的操作步驟并能對驗證結(jié)果做出準確判斷。3.2實訓要求嚴格遵守實訓室管理規(guī)章制度。按照實訓計劃進行操作。認真分析和討論實訓中出現(xiàn)的問題。尊重實訓結(jié)果的科學性。完成實訓任務,達到實訓目的。

更年寧微生物總數(shù)檢查方法驗證3.3實訓內(nèi)容3.3.1實驗環(huán)境無菌室、超凈工作臺。3.3.2設(shè)備、儀器儀器、試劑、菌種及培養(yǎng)基設(shè)備恒溫培養(yǎng)箱30～35℃、生化培養(yǎng)箱23～28℃、勻漿杯。儀器菌落計數(shù)器、錐形瓶(250～300ml,500ml,1000ml)、培養(yǎng)皿(直徑

9cm)、帶塞試管(18mmx180mm,28mm×198mm)、吸管(1ml分度0.01,10ml分度0.1)。玻璃器皿均于高壓蒸汽121℃滅菌30min,烘干。用具白金耳、酒精燈、滅菌剪刀和鑷子、試管架、火柴、記號筆、白瓷盆、實驗記錄紙

更年寧微生物總數(shù)檢查方法驗證3.3.3試劑0.9%無菌氯化鈉溶液、pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、靛基質(zhì)試液3.3.4驗證用菌種及培養(yǎng)基大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念球菌、黑曲霉菌;營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、膽鹽乳糖增菌液、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、MUG培養(yǎng)基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基

更年寧微生物總數(shù)檢查方法驗證3.4實驗步驟3.4.1菌液制備取經(jīng)35℃培養(yǎng)18～24h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌與枯草芽孢桿菌肉湯液體培養(yǎng)物2～3白金耳加入9ml0.9%氯化鈉溶液中,10倍稀釋至10-3～10-7約為50～100cfu/ml,做活菌計數(shù)用。取經(jīng)25℃培養(yǎng)18～24h的白色念珠菌液體培養(yǎng)物2～3白金耳加入9m10.9%

氯化鈉溶液中,10倍稀釋至10-3～10-7約為50～100cfu/ml,做活菌計數(shù)備用。取經(jīng)培養(yǎng)1周的黑曲霉斜面培養(yǎng)物,加0.9%氯化鈉溶液3ml,洗下霉菌孢

子,取0.1ml加入9ml0.9%氯化鈉溶液中,10倍稀釋至10-3～10-7約為50～100cfu/ml,做活菌計數(shù)備用。更年寧微生物總數(shù)檢查方法驗證3.4.2操作方法供試液制備取本品10g置勻漿杯中，加入pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、靛基質(zhì)試液100ml,以4000r/min開機2min,即為1:10的供試液。驗證方法采用常規(guī)法。驗證試驗分4組,至少應進行3次獨立的平行試驗,并分別計算供試品組和對照組試驗的菌回收率。菌液組:分別取上述5種菌液1ml,注入平皿中,傾注培養(yǎng)基,待凝后,置規(guī)定溫度培養(yǎng)24～72h,觀察結(jié)果并計數(shù)。供試品對照組:取1：10供試液1m注入平皿中,傾注培養(yǎng)基,待凝后,置規(guī)定溫度培養(yǎng)24～72h,觀察結(jié)果并計數(shù)。

更年寧微生物總數(shù)檢查方法驗證試驗組:取供試液1ml按供試品對照組同法操作,同時每個平皿加入50～100cfu相應試驗菌1ml,立即傾注瓊脂培養(yǎng)基,待凝固后,置規(guī)定溫度培養(yǎng)24～72h,觀察結(jié)果并計數(shù)。稀釋劑對照組:取相應的稀釋劑1ml注入每個平皿中,并加入50~100cfu相應

試驗菌1ml,立即傾注瓊脂培養(yǎng)基,待凝固后,置規(guī)定溫度培養(yǎng)24～72h,觀察結(jié)果并計數(shù)。3.5注意事項檢驗全過程要嚴格遵守無菌操作。吸取供試液時要先搖勻。供試液從制備到加入培養(yǎng)基不能超過1小時。更年寧微生物總數(shù)檢查方法驗證項目八微生物數(shù)量檢查技術(shù)任務4計數(shù)方法的驗證知識點4計數(shù)方法的驗證步驟4計數(shù)方法的驗證步驟4.1驗證目的為了使微生物學檢驗方法的結(jié)果準確可靠，需要對每個品種的具體檢驗方法進行驗證。

計數(shù)方法的驗證步驟4.2驗證的影響因素：藥品本身的抑菌性藥品中防腐劑的抑菌性培養(yǎng)基的促菌生長能力培養(yǎng)條件（溫度、濕度及需氧或厭氧）過濾系統(tǒng)的材質(zhì)計數(shù)方法的驗證步驟4.3驗證用菌試驗用菌株的傳代次數(shù)不得超過5代(從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代)，并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進行保存，以保證試驗菌株的生物學特性。大腸埃希菌(

Eerhenichin

co)；金黃色葡萄球菌(

Staphylococcus

aureus)；乙型副傷寒沙門菌(

Salmonella

paratyphi

B)；枯草芽泡桿菌(

Bocillus

subtilis)；白色念珠菌(

Candida

albicans)；黑曲霉(

Spergillus

niger)。

計數(shù)方法的驗證步驟4.4菌液制備接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)18～24h；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24～48h。上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1m含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5-7天，加入3～5ml含0.05%(m/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數(shù)50～100cfu的孢子懸液。菌液制備后若在室溫下放置，應在2h內(nèi)使用；若保存在2～8℃，可在24h內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2~8℃，在驗證過的貯存期內(nèi)使用。計數(shù)方法的驗證步驟4.5驗證方法驗證試驗分4組，至少應進行3次獨立的平行試驗，并分別計算供試品組對照組和試驗組的菌回收率。4.5.1試驗組

取最低稀釋級的供試液，按每1ml供試液加入50～100cfu試驗菌，按菌落計數(shù)方法定其菌數(shù)。平皿法計數(shù)時，取試驗菌液、供試液各1m分別注入平皿中，立即傾注球脂培養(yǎng)基：薄膜過濾法計數(shù)時，取供試液2ml過濾，沖洗液沖洗，并在最后一次的沖洗液中加入試驗菌。4.5.2菌液組取上述試驗菌液，測定其加入的試驗菌菌數(shù)。4.5.3供試品對照組取最低稀釋級的供試液1ml，按菌落計數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù)。

計數(shù)方法的驗證步驟4.5.4稀釋劑對照組為考察供試液制備過程中對微生物影響的程度，可用相應的稀液替代供試品，加入試驗菌，使最終菌濃度為每1ml含50～100cfu，按供試品組的供試液制備方法和菌落計數(shù)方法測定其菌數(shù)。4.6回收率計算計數(shù)方法的驗證步驟4.7結(jié)果判定在3次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌數(shù)回收率(稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率)應均不低于70%。若試驗組的菌數(shù)回收率(試驗組的平均菌落數(shù)減去供試品對照組的平均菌落數(shù)的值占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率)均不低于70%，照該供試液制備方法和計數(shù)法測定供試品的細菌、霉菌及酵母菌數(shù)；若任一次試驗中試驗組的菌數(shù)回收率低于70%，應采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法驗證。計數(shù)方法的驗證步驟4.7結(jié)果判定若沒有適宜的方法消除供試品的抑菌活性，那么驗證試驗中微生物回收的失敗可看成是因供試品的抗菌活性引起的，同時表明該供試品不能被試驗菌污染。但是，供試品也可能僅對試驗用菌株具有抑制作用，而對其他菌株沒有抑制作用。因此，根據(jù)供試品須符合的微生物限度標準和菌數(shù)報告規(guī)