耐亞胺培南銅綠假單胞菌的臨床分離及耐藥機制研究

耐亞胺培南銅綠假單胞菌的臨床分離及耐藥機制研究

銅綠假單胞菌（pae）是醫(yī)院感染的最常見因素之一。它對各種抗生素或某些抗生素是臨床感染的焦點。亞胺培南等碳青霉烯類抗生素由于抗菌譜廣、抗菌活性強,已成為目前治療多重耐藥銅綠假單胞菌最有效的抗生素。但隨著該類抗生素臨床應(yīng)用的逐漸增多,出現(xiàn)了大量的耐亞胺培南菌株(imipenem-resistantpseudomonasaeruginosa,IRPA),給臨床治療帶來了極大困難。因此,加強對IRPA的研究,為臨床有效控制其感染提供科學(xué)依據(jù)顯得尤為重要。為了解深圳地區(qū)IRPA的耐藥情況和耐藥機制,作者收集了廣東醫(yī)學(xué)院附屬南山醫(yī)院2009年1月~2010年12月住院患者臨床標(biāo)本中分離的IRPA進(jìn)行分析,現(xiàn)報道如下:1材料和方法1.1材料表面1.1.1金屬酶imp基因陽性菌株404株銅綠假單胞菌分離于我院2009年1月~2010年12月住院部各科患者的各類臨床標(biāo)本(包括痰液、尿液、傷口分泌物、膿液、血液等),同一患者的同一部位連續(xù)分離的多株銅綠假單胞菌以1株計算。金屬酶IMP基因陽性菌株P(guān)A987由廣州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院卓超教授提供。質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853,大腸埃希菌ATCC25922,購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心。1.1.2pcr索引設(shè)計參考文獻(xiàn)1.2方法1.2.1細(xì)菌的培養(yǎng)和分離臨床送檢的各類標(biāo)本嚴(yán)格按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)。分純后的銅綠假單胞菌用小牛血清保存至-80℃冰箱待用。1.2.2細(xì)菌分析方法所有菌株均以BDPhoenix100全自動微生物分析儀鑒定到種,必要時采用梅里埃ATB-Expression半自動細(xì)菌分析儀補充鑒定。藥敏試驗采用BDPhoenix100革蘭陰性細(xì)菌配套藥敏試驗復(fù)合板,包括阿米卡星、阿莫西林/克拉維斯、氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、氨曲南、頭孢唑啉、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢他啶、氯霉素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、亞胺培南、美洛培南、左氧氟沙星、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、四環(huán)素、復(fù)方磺胺、多粘菌素E,共20種抗菌藥物。1.2.3保護(hù)方式以一般通道為三種周期,按照周期l采用煮沸法提取模板DNA,oprD2基因擴增條件為:95℃預(yù)變性3min,然后95℃30s→55℃30s→72℃60s,循環(huán)35個周期,最后72℃延長5min;其余基因擴增條件為:95℃預(yù)變性3min,然后95℃60s→55℃60s→72℃60s,循環(huán)35個周期,最后72℃延長5min。取PCR產(chǎn)物4μg經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,EB染色后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。1.2.4pcr產(chǎn)物測序使用DNA凝膠回收純化試劑盒(購自TaKaRa)將PCR產(chǎn)物割膠純化,送至深圳華大基因測序,序列登錄GenBank進(jìn)行比對分析。2結(jié)果2.1%是速度性侵權(quán)行為,存在于24h的情況下,且符合現(xiàn)狀的需要,且認(rèn)為這4.32%從404株銅綠假單胞菌中檢出IRPA100株,分離率為24.75%。其中大多數(shù)分離自痰液標(biāo)本90株,占90.0%,其次為血液和膿液標(biāo)本,均為3株,各占3.0%,分離自傷口分泌物和膽汁標(biāo)本均為2株,各占2.0%。2.2呼吸外科和神經(jīng)內(nèi)科分布IRPA感染者主要來自重癥醫(yī)學(xué)科,占31.0%,其次為呼吸內(nèi)科和神經(jīng)內(nèi)科,分別為20.0%和16.0%,具體科室分布情況見表2。2.3抗菌藥物的耐藥率100株亞胺培南耐藥的銅綠假單胞菌,對阿米卡星的耐藥率最低,為27.0%,耐藥率在30.0%~50.0%的有4種抗菌藥物:頭孢他啶、慶大霉素、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦;耐藥率在50.0%~70.0%的有4種抗菌藥物:氨曲南、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、頭孢吡肟;對其余10種抗菌藥物的耐藥率均>70.0%,其中,氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、頭孢唑啉和氯霉素的耐藥率為100%。具體耐藥情況見表3。2.4opdr2基因檢測100株IRPA中,檢測到IMP基因陽性1株(PA47),陽性率為1.0%,oprD2基因缺失65株(PA47為擴增陽性菌株),陽性率為65.0%,其余耐藥基因(VIM、GIM、SPM)均未檢出。2.5imp基因檢測通過對PA47菌株的IMP基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行正向測序,經(jīng)ClustalW程序分析,其核酸序列與GenBank已登陸的blaIMP-9序列(登錄號:AY033653)的同源性為100%,可判定為IMP-9型基因。PA47_blaIMP在GenBank的登錄號為JN107561。3irpa對亞胺培南耐藥菌株的篩選結(jié)果近年來,由于化療、放療、免疫抑制劑及各類侵入性診療項目在臨床的廣泛開展,非發(fā)酵類病原菌引起的醫(yī)院感染逐漸增多,其中銅綠假單胞菌分離量占首位(45.4%)我院分離的銅綠假單胞菌對亞胺培南耐藥率為24.75%(100/404),90.0%的菌株從痰液中分離得到,表明耐亞胺培南的銅綠假單胞菌多引起呼吸道感染,是醫(yī)院獲得性肺炎的首位病因,這和國內(nèi)外諸多相關(guān)報道一致在科室分布方面,我院耐亞胺培南銅綠假單胞菌多來自ICU(31.0%),這可能與患者多為急重癥或昏迷階段,免疫力低、病程和住院時間長、有手術(shù)史以及較頻繁地大量使用廣譜抗菌藥物,造成菌群失調(diào),易繼發(fā)感染銅綠假單胞菌,且長時間在藥物選擇性壓力下,耐藥性菌株成為優(yōu)勢菌群,因此,這些科室分離的耐亞胺培南銅綠假單胞菌亦多為多重耐藥菌株。藥敏實驗結(jié)果顯示(表3),100株IRPA中,對阿米卡星的敏感性最好(73.0%),其次是哌拉西林/他唑巴坦(63.0%)、哌拉西林(59.0%)、慶大霉素(58.0%)、頭孢他啶(57.0%),其余藥物的敏感率均<50.0%。100株IRPA對氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、頭孢唑啉、氯霉素全部耐藥。同處廣東地區(qū),我院IRPA對氨基糖苷類和喹諾酮類抗生素的耐藥率均<53.0%,而姚芬等銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥機制包括β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生、外膜通透性的降低和主動外排系統(tǒng)的表達(dá)。金屬酶(metallo-β-lactamases,MBL)是一類能夠水解包括碳青酶烯類在內(nèi)的所有β-內(nèi)酰胺類藥物的β-內(nèi)酰胺酶,主要通過基因盒,整合子和轉(zhuǎn)座子的形式傳播。MBL包括四種類型:IMP型金屬酶,已報道的超過19種;VIM型金屬酶,已超過11種;SPM-1型金屬酶和GIM-1型金屬酶。MBL編碼基因多位于整合子上,其中以IMP型和VIM型最為常見在β-內(nèi)酰胺類抗生素抑菌過程中,首先必須穿透銅綠假單胞菌的外膜進(jìn)入周漿間隙才能起作用,oprD2蛋白是目前所知的PAE外膜中唯一有助于抗生素通過的孔道蛋白,具有配體特異性,能形成亞胺培南的特異結(jié)合位點。一旦oprD2蛋白缺失,PAE對亞胺培南的MIC由1~2mg/L上升至8~32mg/L,而對其他β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物影響并不大,所以碳青酶烯類抗菌藥物與其他β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物無交叉耐藥性。一般認(rèn)為,oprD2孔道蛋白的缺失是PAE對亞胺培南耐藥的主要機制總之,IRPA對臨床常用抗