多重耐藥銅綠假單胞菌金屬-內(nèi)酰胺酶的基因型和流行研究

多重耐藥銅綠假單胞菌金屬-內(nèi)酰胺酶的基因型和流行研究

銅綠假單胞菌（pa）是一種常見的疾病，可導致醫(yī)院感染。金屬β-內(nèi)酰胺酶(metallo-β-lactamase,MBL),簡稱金屬酶,是致使PA對碳青霉烯類抗生素耐藥的重要機制之一。產(chǎn)MBLPA檢出日益增加1材料和方法1.1人民醫(yī)院分類及標本來源收集2011年1—6月長沙地區(qū)7所綜合性醫(yī)院臨床分離的非重復多重耐藥PA81株,其中中南大學湘雅醫(yī)院46株,中南大學湘雅三醫(yī)院14株,瀏陽市人民醫(yī)院7株,長沙市第三醫(yī)院6株,湖南省第二人民醫(yī)院4株,長沙市第一醫(yī)院3株,湖南省人民醫(yī)院1株。標本類型有痰、支氣管分泌物、咽拭子、創(chuàng)面分泌物、血、尿、導管尖端和引流液等。多重耐藥菌PA的判斷標準參照李春輝等1.2培養(yǎng)基和引物VITEK-2GN鑒定板和E-testMBL購自法國生物梅里埃公司。亞胺培南藥敏紙片和M-H培養(yǎng)基干粉購自英國OXOID公司,0.5mol/LEDTA溶液為自行配制,聚合酶鏈反應(PCR)試劑購自美國OMEGA,D2000Marker購自天根生化科技,所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。1.3表中的模型篩選1.4細菌dna模板制備采用煮沸法提取DNA。35℃過夜培養(yǎng),挑取單個待測菌落置于盛有300μL無菌雙蒸水的EP管中,95℃煮10min并置冰上快速冷卻,13000r/min低溫離心10min,上清則為細菌DNA模板,分裝并于-20℃保存?zhèn)溆?。MBL基因PCR:根據(jù)參考文獻1.5菌株同源性分析采用腸桿菌科基因間重復序列聚合酶鏈反應(enterobacterialrepetitiveintergenicconsensus-polymerasechainreaction,ERIC-PCR)分別對產(chǎn)IMP和VIM-2PA進行同源性分析。引物序列為ERIC-2:5’-AAGTAAGTGACT-GGGGTGAGCG-3’。判定標準為:主要的條帶位置和數(shù)量相同則是同一基因型2結果2.1表1中模型篩選經(jīng)EDTA協(xié)同和E-testMBL初步篩查,81株PA中僅10株為強陽性,見圖1~2。2.2u3000apca擴增全部菌株提取DNA直接進行MBL基因擴增,結果顯示,18株PA擴增出明顯條帶。經(jīng)產(chǎn)物測序及BLAST比對,其中IMP-9型11株,IMP-1型1株和VIM-2型6株。未檢測到SIM-1、SPM-1、GIM和NDM-1基因陽性的PA。見圖3。2.3mbl基因pcr擴增EDTA協(xié)同試驗MBL表型陽性的10株PA均擴增到MBL基因,而12株產(chǎn)IMPPA中4株表型初篩陰性,6株產(chǎn)VIM-2PA4株表型初篩陰性。2.4imp和pm-2型mla的原產(chǎn)地產(chǎn)MBLPA菌株分布于長沙地區(qū)多所醫(yī)院,主要分離于重癥監(jiān)護病房(ICU)和燒傷科。詳見表2。2.5a、b、c型聚合酶原螯蝦a、c型12株產(chǎn)IMPPA為多個克隆型,呈現(xiàn)5種型別。其中3、11、13、14、15和SY7為A型,36和T26為B型,T15和843為C型,35為D型,T40為E型,片段大小為250~2000bp,見圖4。而6株產(chǎn)VIM-2銅綠假單胞菌為同一克隆型。見圖5。3菌株同源性分析近年來,PA對以亞胺培南為代表的碳青霉烯類抗生素的耐藥率逐年上升,甚至出現(xiàn)泛耐藥菌株,成為臨床棘手的難題。由于細菌存在地域和醫(yī)院間差異,準確地掌握長沙地區(qū)PA產(chǎn)酶菌株的分子流行病學特征對臨床治療和感染控制具有重要的意義。本組研究結果顯示,長沙地區(qū)產(chǎn)MBLPA菌株以IMP-9和VIM-2基因型為主,與李俏俏本研究采用ERIC-PCR進行菌株同源性分析,原因是其具有操作簡單、成本低、分辨效果好、可重復性較好等優(yōu)點,也常用于臨床實驗室分子流行病學初步監(jiān)測;而脈沖場凝膠電泳方法操作復雜、周期長、耗費高,而且還需配備專門的儀器。ERIC-PCR結果顯示,12株產(chǎn)IMPPA為多個克隆型,散在分布于多個醫(yī)院不同病區(qū),以痰標本來源為主(占75%,9/12)。醫(yī)護人員在診治過程中需高度重視,加強手衛(wèi)生,防止耐藥菌株播散綜上所述,長沙地區(qū)產(chǎn)MBLPA的分離情況不容樂觀,各醫(yī)院需加強此類菌株的耐藥監(jiān)測和實施醫(yī)院感染控制措施。本研究不足之處為菌株主要來源于中南大學湘雅醫(yī)院,其他醫(yī)院菌株收集較少,菌株代表性不足。1.3.1e-toa,edta和亞胺培南藥敏膠片mh的抑菌圈擴大檢測將0.5麥氏單位待測菌液涂布于MH平板,靜置10min,待干燥后在平板中間貼亞胺培南藥敏紙片(10μg/片)和EDTA紙片(0.5moL/LEDTA溶液4μL),紙片邊緣相距10~15mm。35℃過夜培養(yǎng)后,若靠近亞胺培南藥敏紙片處出現(xiàn)抑菌圈擴大或“匙孔現(xiàn)象”則為陽性。在涂有0.5麥氏單位菌液的MH平板上貼商品化E-test條,該