侗藥血馬鞭水提物對吡啶誘導的急性非感染咽喉炎大鼠的保護作用研究

侗藥血馬鞭水提物對吡啶誘導的急性非感染咽喉炎大鼠的保護作用研究*

譚艷輝，張宇，龍娟，李輝，劉文杰，劉志華，吳衛(wèi)華，劉建新（1．湖南醫(yī)藥學院藥學院，懷化418000；2．侗醫(yī)藥研究湖南省重點實驗室，懷化418000）咽喉炎是一種炎癥免疫性疾病，曾被認為是教師的職業(yè)病。由于空氣污染、氣候環(huán)境等多方面因素的影響，咽喉炎的發(fā)病率現(xiàn)已高達30%～50%，成為臨床上的一種常見病和多發(fā)病，且仍有上升趨勢[1－2]。咽喉炎的病因復雜、病程較長、且較難徹底治愈嚴重影響了人們的日常工作和生活[3]。病理研究發(fā)現(xiàn)，咽喉炎的主要病理表現(xiàn)為黏膜充血，淋巴細胞、白細胞、漿細胞等炎癥性細胞的浸潤[4]。目前臨床上用于治療咽喉炎的藥物比較欠缺且不能完全治愈，停藥后容易出現(xiàn)復發(fā)[5]?？咕幬锉粡V泛地用于治療感染性的咽喉炎，但針對非感染性的咽喉炎，抗菌藥物則不能發(fā)揮其作用[6]。糖皮質激素類藥物也被用于治療非感染性咽喉炎，但長期使用則容易出現(xiàn)很多全身性的不良反應[7]。因此，尋找和發(fā)現(xiàn)針對非感染性咽喉炎新的安全有效的治療藥物是當前急需解決的難題。侗藥血馬鞭即廣東紫珠（CallicarpakwangtungensisChun）是馬鞭草科紫珠屬植物，收載入《中華人民共和國藥典》2015版[8]，主要產(chǎn)于中國湖南、湖北、江西、廣西等省。前期實驗研究發(fā)現(xiàn)，藥材中主要含有黃酮、苯丙素糖苷、三萜、酚酸等化學成分[9]。據(jù)民間用藥記錄，侗藥血馬鞭的根、莖、葉、花、籽均可入藥，有清熱解毒、涼血止血、消炎生肌、抗腫瘤等諸多功效?，F(xiàn)代藥理研究證實，侗藥血馬鞭具有抗炎（總黃酮）、抑菌（乙醇提取物、揮發(fā)油）、鎮(zhèn)痛（總黃酮）、止血（乙醇提取物）等作用[10]，提示侗藥血馬鞭在炎癥免疫性疾病中具有很好和廣闊的應用前景。1材料與方法1.1實驗藥物侗藥血馬鞭水提取物浸膏由湖南懷化正好制藥有限公司提供。制備工藝：取1倍份血馬鞭藥草莖葉切段（2～3cm），加入8倍份水，加熱至100℃煮沸后，文火保持煮沸狀態(tài)2h過濾保留濾液。濾渣加入3倍份水重復上述步驟，取第2次過濾濾渣加入2倍份水重復提取過濾。將3次過濾的濾液合并，100℃加熱濃縮至約1倍份容量，冷卻后置于4℃降低溫度，隨后置于低溫真空凍干儀中過夜凍干成干燥棕色粉末浸膏；地塞米松，片劑，安徽金太陽生化藥業(yè)有限公司，批號為1605102。1.2動物SPF級健康雄性SD大鼠，體質量200～250g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2016－0002。1.3試劑伊文思藍（EB），規(guī)格每瓶1g，購自美國Sigma公司；吡啶，規(guī)格每瓶500mL，購自天津市化學試劑六廠三分廠；戊巴比妥鈉，規(guī)格每瓶100g，購自美國GENEWIZ公司；甲酰胺，規(guī)格每瓶500mL，購自于國藥集團化學試劑有限公司。1.4儀器UV－4802紫外可見分光光度計，上海巴玖實業(yè)有限公司；AUY120分析天平，Shimadzu（島津）制作所；RM2235病理切片機，Leica（萊卡）微系統(tǒng)有限公司；AxioScopeA1顯微鏡，ZEISS（蔡司）公司；Histostar包埋機，ThermoShandonLimited（賽默飛世爾科技）有限公司。1.5方法1.5.1動物分組、給藥及造模將SD大鼠按隨機數(shù)字表法隨機分為正常對照組（灌胃生理鹽水，咽部擦拭生理鹽水）、模型對照組（灌胃生理鹽水；咽部擦拭10%吡啶）、吡啶+侗藥血馬鞭灌胃組（灌胃低、高劑量500、1000mg/kg，咽部擦拭10%吡啶）、吡啶+地塞米松組（灌胃地塞米松4mg/kg，咽部擦拭10%吡啶）。大鼠預處理給藥連續(xù)5d，每天早晚各1次。最后1次給藥1h后，大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（劑量60mg/kg，濃度2%）麻醉。約5min后，大鼠尾靜脈注射EB（劑量30mg/kg，濃度5mg/mL）。10min后，用止血鉗和鑷子打開大鼠口腔，將大鼠舌往外稍提出并拉往一邊，采用棉簽吸取130μL10%吡啶溶液，并將其深入大鼠咽部直到感受到阻力，再稍微往回拉，停留轉動5s，連續(xù)3次。造模1h后，處死大鼠，拍照并取材。1.5.2EB－甲酰胺標準曲線的制作精密稱取0．0525gEB固體粉末溶于7mL甲酰胺溶劑中，渦旋混勻，取1mL用等體積稀釋法將其再依次稀釋4個濃度梯度（5個濃度分別為7．5、3．25、1．8125、0．90625、0．453125μg/mL），紫外可見分光光度法（620nm）分別測定5個不同濃度的EB－甲酰胺溶液的吸光度，并根據(jù)吸光度值和濃度繪制標準曲線。1.5.3咽部組織中EB滲透含量測定取各組大鼠咽部組織，并稱質量。加入3．5mL甲酰胺溶劑，55℃溫育24h，然后測量每個樣品在620nm處的吸光度值，根據(jù)EB－甲酰胺標準曲線計算出每個樣本的EB量。1.5.4咽部組織病理檢測每組隨機取3只大鼠不行EB注射，使其咽部組織不被染料滲透，其余實驗步驟同前。實驗結束后獲取大鼠咽部組織，用生理鹽水將其洗凈并吸干表面水分后置于4%甲醛溶液固定3d，然后將組織采用乙醇梯度脫水、二甲苯透明、浸入軟蠟除去二甲苯，隨后進行包埋、切片。采用蘇木精－伊紅（HE）染色法染色，封片后鏡下觀察組織形態(tài)。1.6統(tǒng)計學分析采用GraphpadPrism5．0軟件包進行統(tǒng)學分析，實驗數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差（x±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，P＜0．05表示差異具有統(tǒng)計學意義。圖1侗藥血馬鞭水提物對吡啶誘導的大鼠咽部組織形態(tài)損傷的影響Fig.1EffectofthewaterextractofCallicarpakwangtungensisChunonpyridine-inducedmorphologicaldamageofrat2結果2.1侗藥血馬鞭水提取物對吡啶誘導的急性咽喉炎大鼠咽喉部炎癥反應的保護作用見圖1。正常對照組大鼠咽喉組織部位藍色較淺，提示EB滲出較少、咽喉組織部位未有明顯的炎癥反應。10%吡啶溶液涂抹大鼠咽喉部位造模后，模型對照組大鼠的咽喉組織部位藍色明顯加深，提示EB大量滲出、咽喉組織存在明顯的炎癥反應。陽性藥物地塞米松干預組大鼠咽喉組織部位藍色深度明顯弱于模型對照組大鼠，提示地塞米松可抑制吡啶所誘導的咽喉部組織炎癥反應。與地塞米松組大鼠相似，侗藥血馬鞭水提取物高、低劑量組大鼠咽喉組織部藍色也明顯弱于模型對照組大鼠，且呈劑量依賴，提示侗藥血馬鞭水提取物對吡啶誘導的大鼠咽喉炎具有很好的保護作用。2.2侗藥血馬鞭水提取物對吡啶誘導的急性咽喉炎大鼠咽喉組織EB滲出的影響以所測不同濃度EB－甲酰胺溶液的吸光度值為縱坐標，EB濃度為橫坐標作圖得到EB－甲酰胺標準曲線，見圖2?；貧w方程為＝0．0528X+0．0014，該標曲線性關系較好，R2＝0．9998。見表1，與正常對照組相比，吡啶誘導咽喉炎模型對照組大鼠咽部組織EB滲透量顯著升高（P＜0．01）。與模型對照組大鼠比較，地塞米松組、1000mg/kg侗藥血馬鞭水提取物高劑量組大鼠咽喉組織EB滲透量明顯減少（P＜0．01或P＜0．05），侗藥血馬鞭水提取物低劑量組大鼠咽喉組織EB滲出也有一定程度的下降，但無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）。圖2伊文思藍溶液的標準曲線Fig.2StandardcurveforEvansblue表1侗藥血馬鞭水提物對吡啶誘導的大鼠咽部組織EB滲出的影響Tab.1EffectofthewaterextractofCallicarpakwangtungensisChunonEvansBlueextractioninpyridineinducedrat表1侗藥血馬鞭水提物對吡啶誘導的大鼠咽部組織EB滲出的影響Tab.1EffectofthewaterextractofCallicarpakwangtungensisChunonEvansBlueextractioninpyridineinducedrat注：與正常對照組比較，##P＜0．01，與模型對照組比較，*P＜0．05，**P＜0．01。（mg/kg）動物數(shù)EB滲出量（μg/g組織）正常對照組—50．32±0．07模型對照組—50．66±0．20##地塞米松組460．33±0．07**血馬鞭水提物高劑量組100050．42±0．06*血馬鞭水提物低劑量組50060．52±0．11組別劑量2.3侗藥血馬鞭水提取物對大鼠體質量和各臟器的影響大鼠的體質量分別于實驗過程中每天稱質量獲得。見表2，除地塞米松組大鼠外，其余各組大鼠的體質量在實驗過程中基本保持在穩(wěn)定的水平，未出現(xiàn)明顯的下降。但陽性藥物地塞米松組大鼠自實驗開始后，大鼠體質量呈現(xiàn)逐漸的下降，到實驗最后一次稱質量時組內大鼠體質量平均下降約50g。大鼠處死后，各臟器包括心臟、肝臟、肺臟、脾臟、腎臟被分離和稱質量。結果發(fā)現(xiàn)，與正常對照組大鼠比較，地塞米松組大鼠肝臟質量明顯增加（P＜0．05）而脾臟質量則顯著的低于正常組大鼠（P＜0．01），見表3。而其余各組大鼠各臟器質量與正常組無顯著差異。結果提示，侗藥血馬鞭水提物的治療安全性優(yōu)于地塞米松。2.4侗藥血馬鞭水提取物對吡啶誘導的急性咽喉炎大鼠咽部組織病理損傷的影響大鼠造模完成后，獲取各組大鼠咽喉組織進行病理檢測，見圖3。正常對照組大鼠咽喉組織黏液腺細胞排列緊湊、且未觀察到明顯的炎性細胞的浸潤；而模型對照組大鼠的咽喉組織中則表現(xiàn)為中性粒細胞大量的浸潤、黏液腺細胞排列分散不規(guī)則且部分肥大破裂，并伴隨出血；地塞米松和侗藥血馬鞭水提物高劑量組大鼠咽喉組織僅出現(xiàn)輕微出血、鏡下觀察不到較大的出血點，細胞排列相比模型對照組大鼠有相當大的改善，僅出現(xiàn)個別的黏液腺細胞肥大的狀況；侗藥血馬鞭水提物低劑量組大鼠咽喉組織情況僅比模型組稍有改善，但仍有黏液腺細胞破裂肥大、中性粒細胞增多的表現(xiàn)。提示侗藥血馬鞭水提取物和陽性藥物地塞米松對吡啶所誘導的急性咽喉炎大鼠咽喉組織損傷有較好的保護作用。3討論本研究初步證明了侗藥血馬鞭水提取物對吡啶誘導的急性非感染性咽喉炎大鼠模型具有較好的保護作用。目前，實驗性咽喉炎動物模型的種類不多，其中以氨水直接噴霧大鼠咽喉組織來復制的急性咽喉炎大鼠模型較為經(jīng)典[11]，但死亡率過高，因此使用非常受限。本實驗采用10%的吡啶溶液來建立大鼠急性咽喉炎模型來評估侗藥血馬鞭水提取物的抗咽喉炎作用。該模型于2014年被G．L．Viswanatha等[12]報道，相比氨水急性咽喉炎模型，具有低死亡率、高成功率等優(yōu)點。實驗發(fā)現(xiàn)，該模型建立簡單，且容易控制，造模成功率高。但本模型的建立與G．L．Viswanatha課題組所建立的動物模型還存在有一些差異，比如采用尾靜脈注射EB溶液，而他們則需要建立靜脈給藥通道，因此本實驗的操作大大的縮短了模型建立的時間和減少了對動物的損傷，更有利于藥物的治療評價。圖3侗藥血馬鞭水提物對吡啶誘導的大鼠咽部組織病理損傷的保護作用（×400）Fig.3ProtectiveeffectofthewaterextractofCallicarpakwangtungensisChunonagainstpyridine-inducedhistologicalchangesinrat(×400)表2侗藥血馬鞭水提物對吡啶誘導的大鼠體質量的影響Tab.2EffectofthewaterextractofCallicarpakwangtungensisChunonweightofratsinpyridine-inducedrat（x±s）表2侗藥血馬鞭水提物對吡啶誘導的大鼠體質量的影響Tab.2EffectofthewaterextractofCallicarpakwangtungensisChunonweightofratsinpyridine-inducedrat（x±s）組別劑量（mg/kg）動物數(shù)體質量（g）第1天第2天第3天第4天第5天正常對照組—5249．6±12．1245．4±9．1240．6±8．2241．2±8．2230．6±13．8模型對照組—5253．2±6．9248．1±6．5240．3±6．0237．0±4．9235．7±6．1地塞米松組46230．9±9．5228．8±9．5218．5±14．4201．1±15．7182．6±14．9血馬鞭水提物高劑量組10005243．4±8．8234．5±12．4232．4±12．6232．4±14．6223．6±15．5血馬鞭水提物低劑量組5006232．0±13．0226．7±12．6224．2±14．2227．0±13．1215．0±15．8表3侗藥血馬鞭水提物對吡啶誘導的大鼠各臟器質量的影響Tab.3EffectofthewaterextractofCallicarpakwangtungensisChunonweightofratdifferentorgansinpyridine-inducedrat表3侗藥血馬鞭水提物對吡啶誘導的大鼠各臟器質量的影響Tab.3EffectofthewaterextractofCallicarpakwangtungensisChunonweightofratdifferentorgansinpyridine-inducedrat注：與正常對照組比較#P＜0．05，##P＜0．01。組別劑量（mg/kg）動物數(shù)心臟（g）肝臟（g）脾臟（g）兩肺（g）雙腎（g）正常對照組—50．82±0．088．77±1．750．44±0．171．17±0．222．16±0．22模型對照組—50．90±0．1810．73±1．370．48±0．071．27±0．322．06±0．77地塞米松組460．81±0．1011．55±1．70#0．16±0．03##0．99±0．212．16±0．15血馬鞭水提物高劑量組100050．75±0．168．81±1．660．46±0．161．51±0．161．84±0．56血馬鞭水提物低劑量組50060．79±0．076．77±1．250．52±0．040．93±0．381．98±0．54咽喉組織EB滲出量的增加是吡啶誘導建立大鼠咽喉炎模型成功與否的判斷指標之一，也是藥物干預治療作用的主要藥效評價指標[13]。實驗結果發(fā)現(xiàn)，模型對照組大鼠咽喉組織EB