差示熱量分析課件

微量熱技術(shù)

(Microcalorimetry)

一、熱分析技術(shù)及分類熱分析是在程序控制溫度下，測(cè)量物質(zhì)的物理性質(zhì)隨溫度變化的一類技術(shù)。

程序控制溫度：指用固定的速率加熱或冷卻。

物理性質(zhì)：包括物質(zhì)的質(zhì)量、溫度、熱焓、尺寸、機(jī)械、升學(xué)、電學(xué)及磁學(xué)性質(zhì)等。

一、熱分析技術(shù)及分類熱分析歷史

1780年英國的Higgins使用天平研究石灰粘結(jié)劑和生石灰受熱重量變化。

1915年日本的本多光太郎提出“熱天平”概念。二戰(zhàn)以后，熱分析技術(shù)飛快發(fā)展。

40年代末商業(yè)化電子管式差熱分析儀問世。

1964年提出“差示掃描量熱”的概念。熱分析已經(jīng)形成一類擁有多種檢測(cè)手段的儀器分析方法。

熱分析歷史熱分析技術(shù)的分類:

等熱分析差熱分析示差掃描量熱分析熱重分析逸出氣體分析

熱膨脹儀熱－力法熱－光法電磁熱分析放射熱分析等

熱分析技術(shù)的分類:

熱分析技術(shù)分類物理性質(zhì)分析技術(shù)名稱物理性質(zhì)分析技術(shù)名稱質(zhì)量熱重法尺寸熱膨脹法等壓質(zhì)量變化測(cè)定力學(xué)特性熱機(jī)械分析逸出氣體分析動(dòng)態(tài)熱機(jī)械分析放射熱分析聲學(xué)特性熱發(fā)聲法熱微粒分析熱聲學(xué)法溫度加熱曲線測(cè)定光學(xué)特性熱光學(xué)法差熱分析電學(xué)特性熱電學(xué)法焓差示掃描量熱法磁學(xué)特性熱磁學(xué)法熱分析技術(shù)分類物理性質(zhì)分析技術(shù)名稱物理性質(zhì)分析技術(shù)名稱

熱分析四大支柱：

等熱分析、差熱分析、差示掃描量熱分析、熱機(jī)械分析

——用于研究物質(zhì)的晶型轉(zhuǎn)變、融化、升華、吸附等物理現(xiàn)象以及脫水、分解、氧化、還原等化學(xué)現(xiàn)象。

——快速提供被研究物質(zhì)的熱穩(wěn)定性、熱分解產(chǎn)物、熱變化過程的焓變、各種類型的相變點(diǎn)、玻璃化溫度、軟化點(diǎn)、比熱、純度、爆破溫度和高聚物的表征及結(jié)構(gòu)性能等。

熱分析四大支柱：

微量熱法(包括等溫滴定量熱和差示掃描量熱)是近年來發(fā)展起來的一種研究生物熱力學(xué)與生物動(dòng)力學(xué)的重要結(jié)構(gòu)生物學(xué)方法.它通過高靈敏度、高自動(dòng)化的微量量熱儀連續(xù)和準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)和記錄一個(gè)變化過程的量熱曲線，原位(insitu)、在線(on-line)和無損傷地同時(shí)提供熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)信息

微量熱法(包括等溫滴定量熱和差示掃描量熱)是近年來發(fā)展起

微量熱法具有以下特點(diǎn)：

它不干擾蛋白質(zhì)和核酸的生理功能，具有非特異性的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，即對(duì)被研究蛋白質(zhì)和核酸體系的溶劑性質(zhì)、光譜性質(zhì)和電學(xué)性質(zhì)等沒有任何限制條件。

樣品用量小,方法靈敏度高，測(cè)量時(shí)不需要制成透明清澈的溶液。

量熱實(shí)驗(yàn)完畢的樣品未遭破壞，還可以進(jìn)行后續(xù)生化分析。

微量熱法缺乏特異性。但由于蛋白質(zhì)和核酸本身具有特異性，因此這種非特異性方法有時(shí)可以得到用特異方法得不到的結(jié)果，這有助于發(fā)現(xiàn)新現(xiàn)象和新規(guī)律。

差示熱量分析ppt課件微量熱法在生物大分子研究中的應(yīng)用主有：酶促反應(yīng)蛋白質(zhì)去折疊/折疊抗原-抗體相互作用分子伴侶-底物相互作用藥物-核酸相互作用

微量熱法在生物大分子研究中的應(yīng)用主有：物質(zhì)的三個(gè)基本性質(zhì)即能量、結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)性質(zhì)相互關(guān)聯(lián)

例.水分子中角H-O-H為105

，因?yàn)檫@樣分子能量最??；又如，多肽鏈在溶液中折疊成球蛋白，也是由于要使系統(tǒng)能量最小化。

波譜學(xué)方法可以探測(cè)不同能級(jí)之間的躍遷，即研究樣品分子在光的作用下能量狀態(tài)的變化；而熱分析的方法可以直接量測(cè)樣品分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化時(shí)能量的變化。物質(zhì)的三個(gè)基本性質(zhì)即能量、結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)性質(zhì)相互關(guān)聯(lián)

例.水原理熱分析技術(shù)在升溫或降溫的過程中，物質(zhì)的結(jié)構(gòu)（如相態(tài)）和化學(xué)性質(zhì)會(huì)發(fā)生變化，其質(zhì)量、尺寸及聲、光、電、磁、熱、力等物理性質(zhì)也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化熱分析技術(shù)就是在溫度程序控制的條件下測(cè)量物質(zhì)的物理性質(zhì)與溫度關(guān)系的一類技術(shù)原理在程序控制溫度下，測(cè)量物質(zhì)質(zhì)量的變化，產(chǎn)生了熱重法、等壓質(zhì)量變化測(cè)定和逸出氣檢測(cè)等技術(shù)；測(cè)量樣品幾何尺寸的變化，則有了熱膨脹法；測(cè)量樣品的光學(xué)特性，有熱光學(xué)法；在程序控制溫度下，測(cè)量樣品的電學(xué)特性，有熱電學(xué)法；測(cè)量樣品的磁學(xué)特性，有熱磁學(xué)法；測(cè)量樣品的力學(xué)特性，有熱機(jī)械分析和動(dòng)態(tài)熱機(jī)械法；測(cè)量樣品的熱力學(xué)性質(zhì)，則有等溫滴定量熱、差熱分析和差示掃描量熱法(DSC)測(cè)量樣品的電學(xué)特性，有熱電學(xué)法；差熱分析、等溫滴定量熱和差示掃描量熱技術(shù)應(yīng)用得最廣泛。差熱分析（DTA）是在程序控溫下測(cè)量樣品和參比物的溫度差與溫度的關(guān)系的技術(shù)。等溫滴定量熱（ITC）通過滴定反應(yīng)熱放出或吸收的熱力學(xué)分析，提供結(jié)合反應(yīng)相關(guān)的能量過程的定量特征。差示掃描量熱（DSC）技術(shù)是在程序控溫下測(cè)量輸入到位置與參比物的功率差與溫度的關(guān)系的技術(shù)。差熱分析、等溫滴定量熱和差示掃描量熱技術(shù)應(yīng)用得最廣泛。熱分析所測(cè)定的熱力學(xué)參數(shù)主要是熱焓的變化（

H）。由于在給定溫度下每個(gè)體系總是趨向于達(dá)到自由能最小的狀態(tài)，所以樣品升溫或降溫的過程中，它可轉(zhuǎn)變成具有不同自由能的另一種結(jié)構(gòu)狀態(tài)。分析伴隨著結(jié)構(gòu)變化所發(fā)生的熱焓變化，就可以得到樣品結(jié)構(gòu)變化的某些信息。這就是用差示掃描量熱法來分析生物大分子結(jié)構(gòu)變化的基礎(chǔ)。差示掃描量熱法能精確、快速、方便地同時(shí)提供樣品物理性質(zhì)和能量性質(zhì)相關(guān)信息，這是其它技術(shù)難以做到的。熱分析所測(cè)定的熱力學(xué)參數(shù)主要是熱焓的變化（H）。由于在給定熱分析既可以用于研究物理性質(zhì)的變化，也可研究化學(xué)變化；不僅可測(cè)量熱力學(xué)參數(shù)，也可提供一定的動(dòng)力學(xué)信息。因此熱分析在物質(zhì)組分和結(jié)構(gòu)研究及熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)研究上都是重要的分析手段。熱分析所研究的物質(zhì)可以是無機(jī)物（包括金屬、礦物、陶瓷材料等），也可以是有機(jī)物；既可以是小分子物質(zhì)，也可以研究生物大分子；因此，其研究的對(duì)象遍及物理、化學(xué)、生物、醫(yī)藥、食品、化工、材料、地礦、航天、環(huán)保、考古等多個(gè)領(lǐng)域。在生物學(xué)研究中，研究比較早的是生物膜、膜脂及模擬生物膜的模型膜；隨著熱分析儀器測(cè)量精度的提高，對(duì)生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸的研究也越來越普遍，越來越深入。

熱分析既可以用于研究物理性質(zhì)的變化，也可研究化學(xué)變化；不僅可熱量的測(cè)量與量熱儀熱量是不能直接測(cè)量的，只能通過熱效應(yīng)間接測(cè)量。例如測(cè)量溫差隨時(shí)間的變化或溫差隨地點(diǎn)(位置)的變化，即

T=T(t1)-T(t2)或

T=T(x1)－T(x2)通過測(cè)量不同時(shí)間的溫差間接測(cè)量熱量的最古老的方法就是測(cè)量一定質(zhì)量的水的溫度變化:

Q=Ck

T

T=T(t1)－T(t2)是水溫在t1到t2這段時(shí)間內(nèi)的變化，Q是熱量，Ck是熱容（假定它在測(cè)量范圍內(nèi)是不變的）。通過測(cè)量不同地點(diǎn)的溫差也可以測(cè)量熱量:Q＝K(T)T(t)dt這里T表示溫度，t表示時(shí)間，T是時(shí)間t時(shí)地點(diǎn)x1和x2的溫差，T＝T(x1，t)－T(x2，t)，K是比例系數(shù)。

熱量的測(cè)量與量熱儀不同的量熱儀所依據(jù)的測(cè)量熱量的原理千差萬別，量熱儀的分類也有各種方法。根據(jù)測(cè)量原理的不同，可以分為相變補(bǔ)償型、熱電效應(yīng)補(bǔ)償型、測(cè)量溫差隨時(shí)間變化型、測(cè)量溫差隨地點(diǎn)變化型等；根據(jù)運(yùn)行模式不同，可分為等溫靜態(tài)運(yùn)行、恒溫環(huán)境靜態(tài)運(yùn)行、絕熱靜態(tài)運(yùn)行、絕熱動(dòng)態(tài)掃描運(yùn)行、恒溫環(huán)境掃描動(dòng)態(tài)運(yùn)行等；不同的量熱儀所依據(jù)的測(cè)量熱量的原理千差萬別，量熱儀的分類也有根據(jù)構(gòu)造原理分類：如雙量熱儀、單量熱儀等。用人名命名，如Bunsen量熱儀、Calvet量熱儀等。無論采用哪一種分類方法，都可能會(huì)有某些量熱儀難以明確歸入某一類中去。例如，Calvet量熱儀，可用電補(bǔ)償熱效應(yīng)方式工作在恒溫模式下，也可用恒溫環(huán)境方式測(cè)量不同地點(diǎn)的溫差。還有某些量熱儀不在上述分類的范圍以內(nèi)。

根據(jù)構(gòu)造原理分類：如雙量熱儀、單量熱儀等。

一、等溫滴定量熱法（IsothermalTitrationCalorimetry，ITC）一、等溫滴定量熱法（IsothermalTitratio

等溫滴定量熱法(IsothermalTitrationCalorimetry,ITC)是近年來發(fā)展起來的一種研究生物熱力學(xué)與生物動(dòng)力學(xué)的重要方法，它通過高靈敏度、高自動(dòng)化的微量量熱儀連續(xù)、準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)和記錄一個(gè)變化過程的量熱曲線，原位、在線和無損傷地同時(shí)提供熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)信息。

等溫滴定量熱法(IsothermalTitrati

等溫滴定微量量熱法（ITC）可以檢測(cè)滴定反應(yīng)過程中熱量變化，用來表征生物分子間的相互作用，ITC迅速成為研究生物大分子結(jié)合反應(yīng)的有力工具。等溫滴定微量量熱法（ITC）可以檢測(cè)滴定反應(yīng)過程中熱量

通過滴定反應(yīng)物到含有反應(yīng)所必須的另一反應(yīng)物的樣品溶液中。每次滴定后，反應(yīng)熱放出或吸收，這些都可以被ITC所檢測(cè)到。檢測(cè)到的熱效應(yīng)的熱力學(xué)分析提供了結(jié)合反應(yīng)相關(guān)的能量過程的定量特征，可以直接測(cè)量與常溫下發(fā)生的反應(yīng)過程相關(guān)的能量學(xué)參數(shù)。通過滴定反應(yīng)物到含有反應(yīng)所必須的另一反應(yīng)物的樣品溶液中

ITC的用途：

獲得生物分子相互作用的完整熱力學(xué)參數(shù)，包括結(jié)合常數(shù)KB、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n）、摩爾結(jié)合焓變（ΔH）、摩爾結(jié)合熵變（ΔS）、摩爾恒壓熱容，和動(dòng)力學(xué)參數(shù)(如酶活力、酶促反應(yīng)米氏常數(shù)和酶轉(zhuǎn)換數(shù))等化學(xué)熱力學(xué)參數(shù)描述一個(gè)結(jié)合反應(yīng)ITC的用途：

獲得生物分子相互作用的完整熱力學(xué)參數(shù)，ITC的應(yīng)用范圍：蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(包括抗原-抗體相互作用和分子伴侶-底物相互作用)；蛋白質(zhì)折疊/去折疊；蛋白質(zhì)-小分子相互作用以及酶-抑制劑相互作用；酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；藥物-DNA/RNA相互作用；RNA折疊；蛋白質(zhì)-核酸相互作用；核酸-小分子相互作用；核酸-核酸相互作用；生物分子-細(xì)胞相互作用；……差示熱量分析ppt課件

ITC的特點(diǎn)ITC能測(cè)量到的熱效應(yīng)最低可達(dá)125nJ，最小可檢測(cè)熱功率2nW，生物樣品最小用量0.4μg，靈敏度得到提高，響應(yīng)時(shí)間（小于10s）

ITC不需要固定或改變反應(yīng)物，因?yàn)榻Y(jié)合熱的產(chǎn)生是自發(fā)的。獲得物質(zhì)相互作用完整的熱力學(xué)數(shù)據(jù)包括結(jié)合常數(shù)（Ka）、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n），結(jié)合焓（△H）、恒壓熱容（△Cp）和動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)（如酶促反應(yīng)的Km和kcat）ITC的特點(diǎn)ITC能測(cè)量到的熱效應(yīng)最低可達(dá)125nJ差示熱量分析ppt課件ITC結(jié)構(gòu)原理示意圖ITC結(jié)構(gòu)原理示意圖ITC獲取的結(jié)果示意圖

峰底與峰尖之間的峰面積為每次注射時(shí)釋放或吸收的總熱量

ITC獲取的結(jié)果示意圖峰底與峰尖之間的峰面積為每次注射時(shí)以產(chǎn)生或吸收的總熱量為縱坐標(biāo)，以加入杯中的兩反應(yīng)物之摩爾比為坐標(biāo)作圖，可得整個(gè)反應(yīng)過程的結(jié)合等溫曲線

以產(chǎn)生或吸收的總熱量為縱坐標(biāo)，以加入杯中的兩反應(yīng)物之摩爾比為ITC的應(yīng)用

1）蛋白質(zhì)-小分子和酶-抑制物相互作用；

2）蛋白質(zhì)-糖類相互作用；

3）蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用：如Jacobson等用ITC研究了人細(xì)胞RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子TFIID的最大亞單位TAFII250的組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶活性(Jacobsonetal.,2000)。日本Kanagawa科學(xué)技術(shù)研究所的Tahirov等利用ITC、CD和UV研究了AML1/Runx-1小結(jié)構(gòu)域識(shí)別的DNA結(jié)構(gòu)及CBFβ控制的構(gòu)象調(diào)整，闡明了CBFβ與CBFα間的相互作用模式及前者調(diào)控后者結(jié)合到DNA上的機(jī)制(Tahirov,etal.,2001)。

3）蛋白質(zhì)-脂質(zhì)相互作用；

4）脂質(zhì)間以及脂質(zhì)-小分子相互作用；

5）核酸-小分子相互作用；

6）蛋白質(zhì)-核酸相互作用；

7）核酸-核酸相互作用；ITC的應(yīng)用1）蛋白質(zhì)-小分子和酶-抑制物相互作

8）抗體研究：美國JohnsHopkins大學(xué)生物系的生物量熱學(xué)中心是目前世界上從事生物量熱學(xué)最活躍和處于領(lǐng)先水平的實(shí)驗(yàn)室，該中心的Freire小組(Murphyetal.,1993,1995)應(yīng)用高靈敏度ITC分別研究了血管緊縮素與其單克隆抗體和酸誘導(dǎo)去折疊細(xì)胞色素c與其單克隆抗體的結(jié)合，發(fā)現(xiàn)上述結(jié)合過程均為焓和熵同時(shí)驅(qū)動(dòng)的反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這些過程中溶劑釋放所導(dǎo)致的熵增過量補(bǔ)償了因結(jié)合而引起的構(gòu)象熵的損失。

9）受體相互作用；10）蛋白質(zhì)折疊和穩(wěn)定性：如美國的Wright小組應(yīng)用ITC和核磁共振(NMR)等技術(shù)研究了核激素受體蛋白的一個(gè)結(jié)構(gòu)域與甲狀腺素及類纖維素A受體相互作用的熱力學(xué)，發(fā)現(xiàn)雖然分開的結(jié)構(gòu)域本身很凌亂，但是它們之間有高的親和力而且是焓驅(qū)動(dòng)的，并以一種獨(dú)特的協(xié)同折疊的機(jī)制形成螺旋異二聚體。

11）酶分析：應(yīng)用等溫滴定微量熱法(ITC)結(jié)合高靈敏度差示掃描量熱法(DSC)和分光光度法研究酵母細(xì)胞色素C氧化酶催化氧化其生理底物—亞鐵細(xì)胞色素c的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)，并分析原鹽效應(yīng)對(duì)該酶活性的影響。應(yīng)用等溫微量熱法研究了超氧化物歧化酶催化歧化超氧陰離子等反應(yīng)體系，獲得了這些酶促反應(yīng)的各種熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)信息,探討了相關(guān)催化機(jī)理，同時(shí)用該法研究了博萊霉素催化切割DNA的反應(yīng)，從熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)的角度嚴(yán)格地證明了博萊霉素在催化機(jī)制上類似于DNA切割酶，但其催化效率低于DNA切割酶，并用等溫滴定微量熱法研究了不同濃度鹽酸胍存在時(shí)肌酸激酶催化ATP與肌酸間轉(zhuǎn)磷酸化反應(yīng)的熱力學(xué)，從熱力學(xué)的觀點(diǎn)確定了該酶促反應(yīng)為快速平衡的隨機(jī)順序反應(yīng)，還建立了新的肌酸激酶和超氧化物歧化酶活力測(cè)定方法—微量熱測(cè)活法。

值得指出的是，ITC不僅被應(yīng)用于研究蛋白質(zhì)折疊/去折疊，而且被應(yīng)用于核酸折疊，英國的Hammann等人利用ITC研究了鎂離子誘導(dǎo)錘頭狀核酶折疊的熱力學(xué)，發(fā)現(xiàn)鎂離子與天然序列核酶的結(jié)合是一個(gè)強(qiáng)烈的放熱反應(yīng)，和鎂離子與錘頭狀核酶不同序列變異體的結(jié)合有很大的區(qū)別，這些工作對(duì)于核酸折疊的熱力學(xué)研究是良好的開端。

ITC應(yīng)用示例

ITC法測(cè)量結(jié)合/解離常數(shù):

ChristianHerrmann等運(yùn)用ITC研究了Ras與效應(yīng)物和Cdc42與效應(yīng)物的相互作用。

Ras是一種在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起重要作用的蛋白質(zhì)?？梢韵蚱湎掠蔚脑S多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑輸送細(xì)胞內(nèi)調(diào)控信號(hào)。Ras在非激活態(tài)，與GDP結(jié)合，當(dāng)GDP被GTP取代時(shí)被激活，與其效應(yīng)物（Raf，RalGDS，3-磷脂酰肌醇激酶）呈現(xiàn)更緊密的結(jié)合。Cdc42是一種GTPase，也是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的蛋白。它參與細(xì)胞增殖調(diào)控和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)控。Cdc42在參與細(xì)胞骨架調(diào)控的過程中，很重要的一步是與WASP蛋白的相互作用。Ras及其效應(yīng)物（Raf，RalGDS）的結(jié)合方式都很類似，包括富含親水氨基酸側(cè)鏈的反平行?－折疊。Cdc42及其效應(yīng)物(WASP)的結(jié)合區(qū)則富含疏水氨基酸，其復(fù)合物也比Ras/效應(yīng)物復(fù)合物大得多。

ITC應(yīng)用示例

ITC法測(cè)量結(jié)合/解離常數(shù):

濃度依賴的Ras/RalGDS相互作用

濃度依賴的Ras/RalGDS相互作用利用基于熒光的GDI法測(cè)得Kd＝2.4μM(●)和1.2μM(○)

利用基于熒光的GDI法測(cè)得Kd＝2.4μM(●)和1.2利用ITC測(cè)得Kd＝1.73μM(●)和0.83μM(○）利用ITC測(cè)得Kd＝1.73μM(●)和0.83μM(○

ITC可以直接測(cè)量焓變△H，結(jié)合常數(shù)Ka，而不對(duì)反應(yīng)體系產(chǎn)生影響，也不引入修飾基團(tuán)，因此測(cè)得的結(jié)果更加可信

ITC可以直接測(cè)量焓變△H，結(jié)合常數(shù)Ka，而不對(duì)反應(yīng)體ITC探測(cè)生物分子結(jié)構(gòu)信息:

運(yùn)用ITC研究了DNA結(jié)合蛋白的分子識(shí)別

一般認(rèn)為：形成二聚體是酵母轉(zhuǎn)錄因子GCN4特異性識(shí)別其DNA結(jié)合位點(diǎn)的前提。以天然GCN4的堿性區(qū)（226~252）作為單體肽GCN4－M，以二硫鍵S－S連接的肽作為二聚體肽GCN4－D，研究他們與天然蛋白GCN4的結(jié)合位點(diǎn)AP－1和CRE的相互識(shí)別作用。發(fā)現(xiàn)：?jiǎn)误w肽GCN4－M與DNA的結(jié)合力較弱，但是能夠特異性識(shí)別DNA結(jié)合位點(diǎn)AP－1和CRE。

CCN4－bZIP：天然肽226~281的一段序列；

CCN4－M：合成的從226~252的一段序列，單體肽；

CCN4－D：合成的從226~252的一段序列，二聚體肽；

AP－1與CRE：GCN4的兩個(gè)主要識(shí)別位點(diǎn)；

CONT：非特異性識(shí)別，作為參照的寡聚核苷酸序列。

差示熱量分析ppt課件20℃時(shí)GCN4-D和GCN4-M與AP-1的滴定反應(yīng)和擬合曲線

(a)GCN4-D滴定AP-1；(b)GCN-M滴定AP-1

20℃時(shí)GCN4-D和GCN4-M與AP-1的滴定反應(yīng)和擬合

ITC測(cè)定的反應(yīng)熱既包含結(jié)合反應(yīng)又包含折疊反應(yīng)。肽與DNA結(jié)合過程伴隨著肽的構(gòu)象折疊和疏水表面包埋。肽的構(gòu)象中熵的損失對(duì)熵變的不利貢獻(xiàn)大于溶劑效應(yīng)產(chǎn)生的有利貢獻(xiàn)，由于包埋疏水表面時(shí)所引起的結(jié)合水的損失對(duì)熵變產(chǎn)生有利貢獻(xiàn)，因此肽與DNA結(jié)合過程中總的熵變對(duì)結(jié)合是不利的ITC測(cè)定的反應(yīng)熱既包含結(jié)合反應(yīng)又包含折疊反應(yīng)。肽與DN

產(chǎn)生熵變的因素有：

1）疏水作用產(chǎn)生的有利貢獻(xiàn)；

2）肽與DNA形成復(fù)合物由于轉(zhuǎn)動(dòng)和平移自由度的減小引起的熵?fù)p失；

3）結(jié)合過程中肽與DNA的折疊或其他構(gòu)象變化產(chǎn)生的不利貢獻(xiàn)

GCN4和GCN4－M與AP－1和CRE反應(yīng)是焓驅(qū)動(dòng)。熵變對(duì)反應(yīng)不利，而負(fù)的焓變補(bǔ)償了不利的熵變。與熵的變化類似，反應(yīng)自由能也包含肽鏈折疊所引起的總的自由能的變化和結(jié)合反應(yīng)自由能的變化。結(jié)合作用對(duì)自由能變化的貢獻(xiàn)主要來自于肽與DNA間形成的氫鍵作用、vanderwaals作用以及靜電作用等

GCN4和GCN4－M與AP－1和CRE反應(yīng)是焓驅(qū)動(dòng)。熵

其它應(yīng)用

美國的Todd小組提出了用功率補(bǔ)償型ITC測(cè)定酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的兩種新技術(shù)：(1)將底物溶液不斷滴入酶溶液中，以維持準(zhǔn)一級(jí)反應(yīng)的條件；(2)將底物溶液一次滴入酶溶液中，連續(xù)監(jiān)測(cè)底物被消耗時(shí)的熱功率變化。這兩種技術(shù)均基于反應(yīng)速率和反應(yīng)熱功率成正比的原理，而且只需一次實(shí)驗(yàn)即可獲得高度精確的動(dòng)力學(xué)參數(shù)(如米氏常數(shù)、酶轉(zhuǎn)換數(shù)和抑制常數(shù))。這些技術(shù)被成功應(yīng)用于測(cè)定二氫葉酸還原酶的氧化還原活力、己糖激酶的轉(zhuǎn)換酶活力、幽門螺桿菌脲酶、胰蛋白酶和HIV-1蛋白酶的水解活力、肝素酶的裂解酶活力、丙酮酸羧化酶的連接酶活力

其它應(yīng)用

美國的Todd小組提出了用功率補(bǔ)償型IT

DSC&ITC在藥物研發(fā)中的應(yīng)用

DSC&ITC在藥物研發(fā)中的應(yīng)用

藥物研究開發(fā)周期簡(jiǎn)單劃分為初篩、分析、設(shè)計(jì)、合成和復(fù)篩，一個(gè)成功的新藥上市平均需要15年的時(shí)間和巨額資金投入，約為8.8億美元。在開發(fā)過程中，許多藥物在臨床II期和III期慘遭淘汰，其主要原因是藥物沒有到達(dá)預(yù)期的靶點(diǎn)，從而產(chǎn)生毒副作用。

在藥物設(shè)計(jì)過程中,提前對(duì)藥物的熱力學(xué)性質(zhì)進(jìn)行合理的評(píng)估和篩選,避免在開發(fā)過程中、后期才發(fā)現(xiàn)問題,以減少藥物開發(fā)成本。DSC和ITC在新藥的研發(fā)過程中許多環(huán)節(jié)發(fā)揮篩選功能藥物研究開發(fā)周期簡(jiǎn)單劃分為初篩、分析、設(shè)計(jì)、合成和復(fù)篩差示熱量分析ppt課件差示掃描量熱技術(shù)（DifferentialScanningCalorimetry）

差示掃描量熱技術(shù)

差示掃描量熱法是六十年代以后研制出的一種分析方法

１９６４年，美國的Waston和O`Neill在分析化學(xué)雜志上提出了差示掃描量熱法（DSC）的概念，并自制了DSC儀器．不久，美國Perkin-Elmer公司生產(chǎn)了DSC商品儀器．目前，DSC堪稱熱分析三大技術(shù)中的主要技術(shù)之一差示熱量分析ppt課件差示掃描量熱技術(shù):在樣品和參比同時(shí)程序升溫度或降溫且保持兩者溫度相等的條件下，測(cè)量流入或流出樣品和參比物的熱量差與溫度關(guān)系的一種技術(shù)通過對(duì)試樣因熱效應(yīng)而發(fā)生的能量變化進(jìn)行及時(shí)補(bǔ)償，保持試樣與參比物之間溫度始終保持相同，無溫差、無熱傳遞，使熱損失小，檢測(cè)信號(hào)大。靈敏度和精度大有提高，可進(jìn)行定量分析差示熱量分析ppt課件DSC儀器結(jié)構(gòu)：1.溫度程序控制系統(tǒng)；2.測(cè)量系統(tǒng)，用于樣品物理量轉(zhuǎn)換成電信號(hào)并放大；3.數(shù)據(jù)記錄、處理和顯示系統(tǒng)；4.樣品室，提供適當(dāng)環(huán)境DSC儀器結(jié)構(gòu)：

DSC分析生物大分子結(jié)構(gòu)變化的基礎(chǔ)：

在給定溫度下每個(gè)體系總是趨向于達(dá)到自由能最小的狀態(tài)，樣品升溫或降溫的過程中，它可以轉(zhuǎn)變成具有不同自由能的另一種結(jié)構(gòu)狀態(tài)。分析伴隨著結(jié)構(gòu)變化所發(fā)生的焓變化，就可以得到樣品結(jié)構(gòu)變化的某些信息DSC分析生物大分子結(jié)構(gòu)變化的基礎(chǔ)：兩種主要類型(根據(jù)測(cè)量方法)：熱流型（heatflow)

DSC功率補(bǔ)償型(powercompensation)DSC差示熱量分析ppt課件用爐子控制環(huán)境溫度，測(cè)量通過康銅片流向試樣和參比物的熱流之差。熱流型DSC是屬于熱交換型的量熱計(jì)，與環(huán)境的熱量交換是通過熱阻進(jìn)行測(cè)量，測(cè)量的信號(hào)是溫差，其值表示交換的強(qiáng)度，并與熱流速率

(=dQ/dt)成正比。熱流式差示掃描量熱儀(heatflowDSC)：用爐子控制環(huán)境溫度，測(cè)量通過康銅片流向試樣和參比物的熱流之差將試樣焓變的熱通量幾乎沒有什么損失地被多重?zé)犭娕妓鶞y(cè)得熱通量式差示掃描量熱儀(heatfluxDSC)Calvet熱通量DSC在試樣支架和參比物支架附近的薄壁氧化鋁管壁上安放幾十對(duì)乃至幾百對(duì)互相串聯(lián)著的熱電偶，一端緊貼著管壁，另一端則緊貼著銀均熱塊，將試樣側(cè)多重?zé)犭娕寂c參比物側(cè)多重?zé)犭娕挤唇哟?lián)將試樣焓變的熱通量幾乎沒有什么損失地被多重?zé)犭娕妓鶞y(cè)得熱通量在普通DSC的程序控制加熱的基礎(chǔ)上，是在線性升、降溫的基礎(chǔ)上疊加一個(gè)正弦振蕩溫度程序，產(chǎn)生與之相應(yīng)的循環(huán)熱流。按此種方式，不僅可以測(cè)定總熱流，并可將其分解成可逆成分與不可逆成分兩部分?？偀崃魇莻鹘y(tǒng)DSC的熱流信號(hào)，可逆熱流是熱流的熱容成分溫度調(diào)制型差示掃描量熱儀(TemperatureModulatedDSC,TMDSC)：按試樣相變(或反應(yīng))而形成的試樣和參比物間溫差的方向來提供電功率，以使溫差低于額定值，通常是小于0.01K功率補(bǔ)償型DSC是屬熱補(bǔ)償型量熱計(jì)，待測(cè)的熱量幾乎全部是由電能來補(bǔ)償?shù)墓β恃a(bǔ)償型差示掃描量熱儀(powercompensationDSC)：在普通DSC的程序控制加熱的基礎(chǔ)上，是在線性升、降溫的基礎(chǔ)上熱流型DSC熱流型量熱儀的起源可以追溯到1899年Roberts-Austen開發(fā)的DTA。DTA技術(shù)是將樣品和一種熱惰性參比物一起承受同樣的溫度變化，在溫度變化的時(shí)間范圍內(nèi)連續(xù)測(cè)量樣品和參比物的溫度差。1955年，Boersma將熱電偶裝在儀器中(而不是樣品中)，得到了可重復(fù)的定量結(jié)果。樣品產(chǎn)生的熱通過一個(gè)儀器內(nèi)部的固定的熱通路流動(dòng)，熱量通過溫度差來計(jì)算得到。熱流型DSC

杜邦910熱流型DSC杜邦910熱流型DSC杜邦910熱流型DSC是以Boersma的設(shè)計(jì)原理為基礎(chǔ)的熱流型DSC。該儀器的特點(diǎn)是樣品和參比物平臺(tái)都在一個(gè)完整的康銅盤上，在相同的功率下由一個(gè)熱源加熱，利用康銅盤把熱量傳輸?shù)綐悠泛蛥⒈任?，康銅盤同時(shí)還作為測(cè)量溫度的熱電偶結(jié)點(diǎn)的一部分（一極）。傳輸?shù)綐悠泛蛥⒈任锏臒崃鞑钔ㄟ^樣品和參比物平臺(tái)下的鎳鉻板與康銅板的結(jié)點(diǎn)所構(gòu)成的鎳鉻-康銅熱電偶進(jìn)行監(jiān)控記錄樣品和參比物的溫差。樣品溫度由鎳鉻板下方的鎳鉻-鎳鋁熱電偶直接監(jiān)控。

杜邦910熱流型DSC是以Boersma的設(shè)計(jì)原理為基礎(chǔ)的熱

這樣熱流型DSC實(shí)際上測(cè)定的量是樣品與參比物的溫差（ΔT=TS-TR），然后根據(jù)熱流方程，將ΔT換算成dH/dt（熱功率差）作為信號(hào)的輸出熱流型DSC特點(diǎn)：基線穩(wěn)定；高靈敏度這樣熱流型DSC實(shí)際上測(cè)定的量是樣品與參比物的溫差（Δ圖杜邦910型DSC的原理圖1.康銅板；2.熱電偶結(jié)點(diǎn)；3.鎳鉻合金板；4.鎳鋁絲；5.鎳鉻絲；6.加熱塊。

圖杜邦910型DSC的原理圖這種熱流型DSC的等效熱路示于下圖。R為樣品和參比物的臂熱阻，Rb為橋式熱阻，Rg為通過凈化氣體的泄漏熱阻，iS和iR分別為樣品和參比物的熱流

杜邦910型DSC的等效熱路

這種熱流型DSC的等效熱路示于下圖。R為樣品和參比物的臂熱阻根據(jù)Kirchoff定律，可得下列方程式:式中，T為爐溫，TS、TR分別為樣品和參比物的溫度。

根據(jù)Kirchoff定律，可得下列方程式:式中，T為爐溫，T由上面兩個(gè)式子可推出：其中

T=TR-TS

從上式可以看出，樣品和參比物的溫度差T與熱流差成正比。這樣，經(jīng)過適當(dāng)?shù)臉?biāo)定，即可從測(cè)量到的溫差推算出熱流差。由上面兩個(gè)式子可推出：CalvetDSC也是一類有代表性的熱流型DSC。在CalvetDSC中，樣品和參比樣品室均由溫差電堆環(huán)繞，這兩個(gè)溫差電堆連接在一起，方向相反，即可直接測(cè)量熱流。特點(diǎn)：樣品與參照物之間的熱通路及樣品和環(huán)境之間的通路都是由測(cè)量溫度的傳感器熱電堆構(gòu)成的。環(huán)境和樣品及環(huán)境和參照樣品間的熱流由熱電堆分別測(cè)量。這兩個(gè)等同的系統(tǒng)放在一個(gè)均熱塊中，按照差熱成對(duì)原則來使用位于測(cè)量系統(tǒng)和塊之間的溫差電堆，以此來抵銷均熱塊的溫度波動(dòng)，并通過降低基線的波動(dòng)來提高儀器的靈敏度。

CalvetDSC也是一類有代表性的熱流型DSC。溫差電堆本身既可以作為系統(tǒng)和環(huán)境之間的熱傳導(dǎo)通道，又可以從其接點(diǎn)的溫差電勢(shì)得到產(chǎn)生沿線圈的熱流的溫度差，由溫度差求出熱流。實(shí)際儀器中使用了大量的(上千的)溫差電堆，這樣不僅可以減少熱阻，而且可以從一系列溫差電堆熱流的總和得到總熱流，提高信號(hào)強(qiáng)度。在新型的CalvetDSC中，大量的半導(dǎo)體溫差電偶均勻分布在樣品和參比樣品室周圍，半導(dǎo)體溫差電偶同時(shí)起溫度測(cè)量和溫度控制的作用。Calvet量熱儀的分辨率高(對(duì)應(yīng)于10

5K的

T，分辨率為10

5W或10

2J以上)，其缺點(diǎn)是時(shí)間常數(shù)比較大。其詳細(xì)的測(cè)量原理這里就不再介紹了。溫差電堆本身既可以作為系統(tǒng)和環(huán)境之間的熱傳導(dǎo)通道，又可以從其差示熱量分析ppt課件功率補(bǔ)償型DSC功率補(bǔ)償型DSC的主要特點(diǎn)是分別用獨(dú)立的加熱器和傳感器來測(cè)量和控制樣品和參比物的溫度并使之相等?；蛘哒f，根據(jù)樣品和參比的溫度差對(duì)流入或流出樣品和參比的熱量進(jìn)行功率補(bǔ)償使之相等。它所測(cè)量的參數(shù)是兩個(gè)加熱器輸入功率之差d(ΔQ)/dt或dH/dt。功率補(bǔ)償型DSC差示熱量分析ppt課件功率補(bǔ)償型DSC的結(jié)構(gòu)

功率補(bǔ)償型DSC的結(jié)構(gòu)功率補(bǔ)償式差示掃描量熱儀示意圖功率補(bǔ)償式差示掃描量熱儀示意圖零點(diǎn)平衡原理：

零點(diǎn)平衡原理：DynamicSampleChamberReferencePanSamplePanLidGasPurgeInletChromel

DiscHeating

BlockChromelDiscAlumelWireChromelWireThermocoupleJunctionThermoelectricDisc(Constantan)DynamicSampleChamberReferenc

功率補(bǔ)償型DSC工作基于“零位平衡”原理

零位平衡的原理:

DSC熱系統(tǒng)可分為兩個(gè)控制環(huán)路，其中一個(gè)環(huán)路作為平均溫度控制，以保證按照一定的速率去升高樣品和參比物的溫度；第二個(gè)環(huán)路是用來保證當(dāng)樣品和參比物之間一旦出現(xiàn)溫度差時(shí)能夠調(diào)節(jié)功率輸入以消除這種溫度差差示熱量分析ppt課件

試樣在加熱的過程中，由于熱效應(yīng)與參比物之間出現(xiàn)溫差時(shí)，通過差熱放大電路和差熱補(bǔ)償放大器，使得流入補(bǔ)償電熱絲的電流發(fā)生變化：

當(dāng)試樣吸熱時(shí)，補(bǔ)償放大器使得試樣一邊的電流立即增大；反之則是參比物一邊的電流增大，直到兩邊的熱量平衡，試樣與參比物的溫差消失為止。

這樣通過連續(xù)不斷地自動(dòng)調(diào)節(jié)加熱器的功率，總是可以使樣品托架的溫度與參比托架的溫度保持相同。

這時(shí)，有一個(gè)與輸入到樣品池的熱流和輸入到參比池的熱流之間的差值成正比的信號(hào)dH/dt被饋送到記錄儀中，同時(shí)記錄樣品和參比物的平均溫度，將信號(hào)dH/dt對(duì)時(shí)間或平均溫度作圖就得到了功率補(bǔ)償型DSC曲線。

功率補(bǔ)償型DSC特點(diǎn)：精確的溫度控制和測(cè)量；更快的響應(yīng)時(shí)間和冷卻速度；高分辨率

試樣在加熱的過程中，由于熱效應(yīng)與參比物之間出現(xiàn)溫差整個(gè)儀器由兩個(gè)控制系統(tǒng)進(jìn)行監(jiān)控。（1）控制溫度，使樣品和參比物在預(yù)定的速率下升溫或降溫。（2）用于補(bǔ)償樣品和參比物之間所產(chǎn)生的溫差，這個(gè)溫差是由樣品的放熱或吸熱效應(yīng)產(chǎn)生的。通過功率補(bǔ)償使樣品和參比物的溫度保持相同

W=dQs/dtdQR/dt=dH/dt其中，W為所補(bǔ)償?shù)墓β?Qs為樣品的熱量；QR為參比物的熱量;dH/dt為單位時(shí)間內(nèi)的焓變，即熱流率，單位一般為mJ/s。

整個(gè)儀器由兩個(gè)控制系統(tǒng)進(jìn)行監(jiān)控。

儀器樣品和參比物的加熱器電阻相等，RS=RR，當(dāng)樣品沒有任何熱效應(yīng)時(shí)IS2

RS＝IR2

RR如果樣品產(chǎn)生熱效應(yīng)，樣品和參比物之間產(chǎn)生溫差，儀器立即進(jìn)行功率補(bǔ)償。所補(bǔ)償?shù)墓β蕿?

W=IS2RS

IR2RR令RS=RR=R，即得:

W=R(IS+IR)(IS

IR)儀器樣品和參比物的加熱器電阻相等，RS=RR，當(dāng)樣品沒有任定義IS+IR=IT上式化為

W=IT(ISRIRR)

W=IT(VS

VR)=IT

V

式中，IT為總電流，V為電壓差。 如果IT為常數(shù)，則W與

V成正比。因此用

V可直接表示dH/dt。定義IS+IR=IT熱量變化與曲線峰面積的關(guān)系

考慮到樣品發(fā)生熱量變化（吸熱或放熱）時(shí)，此種變化除傳導(dǎo)到溫度傳感裝置（熱電偶、熱敏電阻等）以實(shí)現(xiàn)樣品（或參比物）的熱量補(bǔ)償外，尚有一部分傳導(dǎo)到溫度傳感裝置以外的地方，因而差示掃描量熱曲線上吸熱峰或放熱峰面積實(shí)際上僅代表樣品傳導(dǎo)到溫度傳感器裝置的那部分熱量變化。樣品真實(shí)的熱量變化與曲線峰面積的關(guān)系為m·

H=K·A

m——樣品質(zhì)量；

H——單位質(zhì)量樣品的焓變；

A——與

H相應(yīng)的曲線峰面積；

K——修正系數(shù)，稱儀器常數(shù)。熱量變化與曲線峰面積的關(guān)系考慮到樣品發(fā)生熱量變化（吸熱

典型的差示掃描量熱（DSC）曲線以熱流率（dH/dt）為縱坐標(biāo)、以時(shí)間（t）或溫度（T）為橫坐標(biāo)，dH/dt-t（或T）曲線。曲線離開基線的位移即代表樣品吸熱或放熱的速率（mJ·s-1），而曲線中峰或谷包圍的面積即代表熱量的變化。因而差示掃描量熱法可以直接測(cè)量樣品在發(fā)生物理或化學(xué)變化時(shí)的熱效應(yīng)。典型的DSC曲線典型的差示掃描量熱（DSC）曲線以熱流率（dH/dt在DSC分析中蛋白質(zhì)變性過程的基本參數(shù)有:

蛋白質(zhì)的變性溫度Tm,蛋白質(zhì)變性的熱容ΔCp,蛋白質(zhì)變性的焓ΔH（見右圖）。

此外,ＤＳＣ曲線上峰面積與峰高的比值可用于表示蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中間態(tài)的情況

DSC曲線圖在DSC分析中蛋白質(zhì)變性過程的基本參數(shù)有:

蛋白差示掃描量熱儀結(jié)構(gòu)熱分析儀大致由下列幾部分組成：溫度程序控制系統(tǒng)：整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中溫度變化的順序、變溫的起始溫度和終止溫度、變溫速率、恒溫溫度及恒溫時(shí)間等的控制測(cè)量系統(tǒng)(物理性能的測(cè)量)：將樣品的某種物理量轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，進(jìn)行放大，用來進(jìn)一步處理和記錄數(shù)據(jù)記錄、處理和顯示系統(tǒng)：把所測(cè)量的物理量隨溫度和時(shí)間的變化記錄下來，并可以進(jìn)行各種處理和計(jì)算，再輸出到輸出和打印設(shè)備顯示和打印。差示掃描量熱儀結(jié)構(gòu)樣品室：樣品室除了提供樣品本身放置的容器(樣品杯或樣品管)、樣品容器的支撐裝置、進(jìn)樣裝置等外，還包括提供樣品室內(nèi)各種實(shí)驗(yàn)環(huán)境的系統(tǒng)，如維持環(huán)境氣氛所需氣氛（氮?dú)狻⒀鯕?、氫氣、氦氣等）的輸入測(cè)量系統(tǒng)、壓力控制系統(tǒng)、環(huán)境溫度控制系統(tǒng)等?，F(xiàn)在的儀器一般由一臺(tái)計(jì)算機(jī)執(zhí)行儀器的溫度控制、測(cè)量控制、進(jìn)樣控制和環(huán)境條件控制等控制功能并進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄、處理和顯示。樣品池：樣品室：樣品室除了提供樣品本身放置的容器(樣品杯或樣品管)、為了得到精確的測(cè)量結(jié)果，DSC必須經(jīng)常進(jìn)行溫度和量熱的校正。溫度校正常采用已知相變溫度較均勻地分布在所測(cè)量溫度范圍內(nèi)且相變溫度比較溫定、相變峰比較尖銳的物質(zhì)如高純銦(其熔融溫度為157

C)和三苯甲烷作為標(biāo)準(zhǔn)。量熱校正可采用已知相變熱焓的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。測(cè)定有機(jī)物時(shí)，應(yīng)采用有機(jī)標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行校正。

為了得到精確的測(cè)量結(jié)果，DSC必須經(jīng)常進(jìn)行溫度和量熱的校正。一些影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素

差示掃描量熱法的影響因素與具體的儀器類型有關(guān)。一般來說，影響DSC測(cè)量結(jié)果的主要因素大致有下列幾方面：實(shí)驗(yàn)條件：例如起始和終止溫度、升溫速率、恒溫時(shí)間等；樣品特性：樣品用量、固體樣品的粒度、裝填情況，溶液樣品的緩沖液類型、濃度及熱歷史等；參比物特性：參比物用量、參比物的熱歷史等。

一些影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素實(shí)驗(yàn)條件的影響影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的主要實(shí)驗(yàn)條件是升溫速率：降低升溫速率會(huì)提高分辨率，降低靈敏度；反之，提高升溫速率會(huì)提高靈敏度，降低分辨率。實(shí)驗(yàn)中常常會(huì)遇到這種情況：對(duì)于某種蛋白質(zhì)溶液樣品，升溫速率高于某個(gè)值時(shí)，某個(gè)熱變性峰根本無法分辨，而當(dāng)升溫速率低于某個(gè)值后，就可以分辨出這個(gè)峰。說明升溫速率可能影響DSC測(cè)量的分辨率。實(shí)驗(yàn)條件的影響升溫速率對(duì)分辨率的影響可以解釋如下：如果兩個(gè)熱過程發(fā)生的溫度比較接近，當(dāng)升溫速率較低時(shí)，第二個(gè)過程還沒有開始，第一個(gè)過程已經(jīng)結(jié)束了，因此這兩個(gè)過程能夠分辨開來。升溫速率較高時(shí)，第一個(gè)熱變化過程中還沒有達(dá)到平衡，第二個(gè)過程就開始了。這樣，兩個(gè)過程就無法分辨了升溫速率對(duì)分辨率的影響可以解釋如下：升溫速率對(duì)靈敏度的影響樣品熔融時(shí)會(huì)吸收熱能,樣品的溫度基本不變而參照物的溫度會(huì)按照設(shè)定的升溫程序繼續(xù)升高。熔融過程結(jié)束后，樣品和參照物之間的溫度要重新達(dá)到平衡。升溫速率較低時(shí)，樣品相對(duì)于參照物的溫度滯后較少，樣品曲線偏離參照物曲線的部分的面積（圖中的A

,速率峰面積）較小，而升溫速率較高時(shí)，這個(gè)面積比較大（圖中的A

）,峰形也會(huì)變得尖銳。而這個(gè)面積與熔融過程中的熱流成正比。因此，升溫速率較高時(shí)熔融過程中的熱流較大，即信號(hào)較強(qiáng)，在這種意義上也可以說靈敏度較高。升溫速率對(duì)靈敏度的影響率較高時(shí)，這個(gè)面積比較大（圖中的A升溫速率不僅影響峰溫的位置和峰形,也會(huì)影響峰面積的大小.事實(shí)上，改變升溫速率也是獲得有關(guān)樣品的某些重要參量的重要手段升溫過快也使試樣分解偏離平衡條件得程度也會(huì)相應(yīng)升高，因此會(huì)出現(xiàn)基線漂移，更可能會(huì)導(dǎo)致相鄰兩峰的重疊而導(dǎo)致分辨率的下降。然而較慢的升溫速度基線漂移相對(duì)較小，整個(gè)體系也更接近平衡的條件，可以得到寬而淺的峰，相鄰的兩峰也能很好的分離，分辨率也會(huì)相對(duì)較高升溫速率不僅影響峰溫的位置和峰形,也會(huì)影響峰面積的大小.事實(shí)差示熱量分析ppt課件樣品特性的影響

樣品量一般來說，樣品量太少，儀器靈敏度不足以測(cè)出所要得到的峰。而樣品量過多，又會(huì)使樣品內(nèi)部傳熱變慢，使峰形展寬，分辨率下降。實(shí)際中發(fā)現(xiàn)，樣品用量對(duì)不同物質(zhì)的影響也有差別。一般要求在得到足夠強(qiáng)的信號(hào)的前提下，樣品量要盡量少一點(diǎn)，且用量要恒定，保證結(jié)果的重復(fù)性。

樣品特性的影響

固體樣品的幾何形狀樣品的幾何形狀如厚度、與樣品盤的接觸面積等會(huì)影響熱阻，對(duì)測(cè)量結(jié)果也有明顯影響。為獲得比較精確的結(jié)果，要增大樣品盤的接觸面積，減小樣品的厚度，并采用較慢的升溫速率。樣品池和池座要接觸良好，樣品池或池座不干凈，或樣品池底不平整，會(huì)影響測(cè)量結(jié)果固體樣品的幾何形狀

樣品池在樣品座上的位置樣品池在樣品座上的位置會(huì)影響熱阻的大小，應(yīng)該盡量標(biāo)準(zhǔn)化。

固體樣品的粒度樣品的粒度太大，熱阻變大，樣品熔融溫度和熔融熱焓偏低；但粒度太小，由于晶體結(jié)構(gòu)的破壞和結(jié)晶度的下降，也會(huì)影響測(cè)量結(jié)果。帶靜電的粉狀樣品，由于靜電引力使粉末聚集，也會(huì)影響熔融熱焓。總的來看，粒度的影響比較復(fù)雜，有時(shí)難以得到合理的解釋。樣品池在樣品座上的位置

粒度對(duì)于峰形的影響

A:粒度最大，三個(gè)峰重疊；b:粒度適中，三個(gè)峰可以明顯區(qū)分；

c:試樣粒度過小，只出現(xiàn)兩個(gè)峰

樣品的熱歷史許多材料往往由于熱歷史的不同而產(chǎn)生不同的晶型和相態(tài)(包括某些亞穩(wěn)態(tài))，對(duì)DSC測(cè)量結(jié)果也會(huì)有較大的影響。

溶液樣品中溶劑或稀釋劑的選擇溶劑或稀釋劑對(duì)樣品的相變溫度和熱焓也有影響，特別是蛋白質(zhì)等樣品在升溫過程中有時(shí)會(huì)發(fā)生聚沉的現(xiàn)象，而聚沉產(chǎn)生的放熱峰往往會(huì)與熱變性吸熱峰發(fā)生重疊，并使得一些熱變性的可逆性無法觀察到，影響測(cè)量結(jié)果。選擇適當(dāng)?shù)木彌_液系統(tǒng)有可能避免聚沉。

樣品的熱歷史從DSC獲得的信息與主要參量

DSC直接記錄熱流量隨時(shí)間和溫度變化的曲線，從曲線中可以得到一些重要的參數(shù)。

如：轉(zhuǎn)變溫度、焓變、熵變、自由能、比熱，還可以分析出純度、協(xié)同性、結(jié)合/解離常數(shù)、酶促反應(yīng)常數(shù)等從DSC獲得的信息與主要參量轉(zhuǎn)變溫度

如果樣品在升溫或降溫的過程中結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，樣品就可能吸熱或放熱，如果樣品分子發(fā)生結(jié)構(gòu)變化的協(xié)同性比較高，DSC曲線上就會(huì)出現(xiàn)一個(gè)吸熱峰或放熱峰，從DSC曲線上可以找到結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)變的溫度即轉(zhuǎn)變溫度。首先需要確定基線，一般是將熱效應(yīng)發(fā)生前后的基線連接起來作為基線。一般采用兩種轉(zhuǎn)變溫度，一是轉(zhuǎn)變峰的起始邊的切線與基線的交點(diǎn)處的溫度即外推始點(diǎn)Te，二是將轉(zhuǎn)變峰溫(Tp)作為轉(zhuǎn)變溫度?，F(xiàn)在DSC儀器本身都帶有計(jì)算峰溫的程序。

轉(zhuǎn)變溫度圖由DSC曲線確定轉(zhuǎn)變溫度

圖由DSC曲線確定轉(zhuǎn)變溫度熱焓熱焓是一個(gè)重要的熱力學(xué)參數(shù)，樣品分子的物理變化(如相變)和化學(xué)變化(如物質(zhì)的分解、鍵的斷裂等)都與熱焓有關(guān)，因此熱焓的測(cè)定也就具有很重要的意義.根據(jù)定義，焓H＝E＋PV，這里E是系統(tǒng)的內(nèi)能，P、V分別為系統(tǒng)的體積和壓力。我們所說的DSC測(cè)量的熱焓，確切地說應(yīng)是焓變，即樣品發(fā)生熱轉(zhuǎn)變前后的

H。對(duì)于壓力不變的過程，

H等于變化過程所吸收的熱量Q。所以，有些文獻(xiàn)中常常將焓變

H與熱量Q等同起來。要比較不同物質(zhì)的轉(zhuǎn)變焓，還需要將

H歸一化，即求出1摩爾樣品分子發(fā)生轉(zhuǎn)變時(shí)的焓變。實(shí)際測(cè)量時(shí)，只要將樣品發(fā)生轉(zhuǎn)變時(shí)吸收或放出的熱量除以樣品的摩爾數(shù)就可以了。

熱焓

差示掃描量熱儀直接記錄的是熱流量隨時(shí)間變化的曲線，該曲線與基線所構(gòu)成的峰面積與樣品熱轉(zhuǎn)變吸收或放出的熱量成正比。根據(jù)已知相變焓的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的樣品量(摩爾數(shù))和實(shí)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)樣品DSC相變峰的面積，就可以確定峰面積與熱焓的比例系數(shù)。這樣，要測(cè)定未知轉(zhuǎn)變焓樣品的轉(zhuǎn)變焓，只需確定峰面積和樣品的摩爾數(shù)就可以了。如果峰的前后基線有變化，要準(zhǔn)確定出峰面積是不太容易的，對(duì)于復(fù)雜的峰形就更難了。下圖給出了一些確定峰面積的參考原則?，F(xiàn)在DSC的計(jì)算機(jī)中都有按照某種默認(rèn)的原則計(jì)算峰面積的程序。

差示掃描量熱儀直接記錄的是熱流量隨時(shí)間變化的曲線圖一些確定峰面積的方法

圖一些確定峰面積的方法比熱

DSC的靈敏度高，熱響應(yīng)速度快，操作簡(jiǎn)便；與常規(guī)的量熱計(jì)熱容測(cè)定法相比，樣品用量少，測(cè)定速度快，操作簡(jiǎn)便。在DSC中，樣品是處在線性的程序溫度控制下，流入樣品的熱流速率是連續(xù)測(cè)定的，并且所測(cè)定的熱流速率dH/dt與樣品的瞬間比熱成正比，因此熱流速率可用下列方程式表示：dH/dt=mCpdT/dt

式中H為熱焓，m為樣品質(zhì)量，Cp為樣品比熱。樣品的比熱即可通過上式測(cè)定。

比熱在比熱的測(cè)定中通常是以某種比熱已精確測(cè)定的樣品作為標(biāo)準(zhǔn)樣品。樣品比熱的具體測(cè)定方法加下：先用兩個(gè)空樣品池在較低溫度(T1)下恒溫記錄一段基線，然后轉(zhuǎn)入程序升溫，然后在一較高溫度(T2)下恒溫，由此得到從溫度T1到T2的空載曲線或基線。T1到T2即我們測(cè)量的范圍。然后在相同條件下使用同樣的樣品池依次測(cè)定已知比熱的標(biāo)準(zhǔn)樣品和樣品的DSC曲線，測(cè)得結(jié)果如下圖所示。在比熱的測(cè)定中通常是以某種比熱已精確測(cè)定的樣品作為標(biāo)準(zhǔn)樣品。圖比熱的測(cè)量

圖比熱的測(cè)量y=dH

/dt=m

C

pdT/dt，y=dH/dt=mCpdT/dt樣品在任一溫度下的比熱Cp可通過下列方程式求出：

C

p、m

、y

分別為已知比熱的標(biāo)準(zhǔn)樣品的比熱、質(zhì)量和標(biāo)準(zhǔn)樣品DSC曲線與基線之間的y軸量程差，而Cp、m和y分別為樣品的相應(yīng)值。為了提高測(cè)量的精確度，應(yīng)選用較高的靈敏度，且樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品的樣品制備條件和測(cè)量條件應(yīng)盡量相同。

y=dH/dt=mCpdT/dt，樣品純度根據(jù)樣品和雜質(zhì)的性質(zhì)，純度分析的方法可以是各種各樣的。用差示掃描量熱法進(jìn)行純度分析，具有快速、精確、樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)。樣品純度用DSC進(jìn)行純度測(cè)定的理論基礎(chǔ)是范得華方程，由范得華方程可以導(dǎo)出熔點(diǎn)降低與雜質(zhì)含量的關(guān)系：T0為平衡時(shí)純樣品的熔點(diǎn)(K)；Tm為平衡時(shí)含雜質(zhì)樣品的熔點(diǎn)(K)；

H為純樣品的摩爾熔融熱焓，單位為卡/克分子；X為樣品中所含雜質(zhì)的克分子數(shù)；R為氣體常數(shù)(1.987卡/克分子

K)；F為樣品在融化過程中的熔融分?jǐn)?shù)：

這里Ts是熔化過程中樣品的溫度。

用DSC進(jìn)行純度測(cè)定的理論基礎(chǔ)是范得華方程，由范得華方程可以由，可得出根據(jù)DSC曲線，ΔH由峰面積求得。在DSC曲線上選擇若干個(gè)點(diǎn)，分別得到相應(yīng)的Ts并算出F值，Ts對(duì)1/F作圖，得到一條直線，其斜率為－RT20X/ΔH，截距為T0。這樣，從斜率就可以求出樣品中所含雜質(zhì)的克分子數(shù)X由，可得出用DSC測(cè)定純度時(shí)，必須滿足范得華方程要求的條件：1.樣品和雜質(zhì)形成低共熔體，而不能形成固熔體。2.液相中樣品和雜質(zhì)應(yīng)互溶為一理想溶液，即其活度系數(shù)為1。3.雜質(zhì)濃度小，即溶液為稀溶液。4.固相與液相應(yīng)處于熱力學(xué)平衡狀態(tài)。5.雜質(zhì)應(yīng)該不揮發(fā)、不分解、不離解、不締合，不與樣品發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。用DSC測(cè)定純度時(shí)，必須滿足范得華方程要求的條件：用DSC測(cè)定物質(zhì)熔融峰時(shí)，樣品的純度對(duì)DSC曲線的峰高和峰寬有明顯的影響。因此，通過簡(jiǎn)單的峰形對(duì)比也可簡(jiǎn)便地估計(jì)樣品的純度。右圖所示的是不同純度的乙酰對(duì)氨苯乙醚的DSC曲線。

圖不同純度的乙酰對(duì)氨苯乙醚的DSC曲線

用DSC測(cè)定物質(zhì)熔融峰時(shí)，樣品的純度對(duì)DSC曲線的峰高和峰寬對(duì)于具體的樣品和具體的反應(yīng)，根據(jù)一定的理論模型，人們還可以從DSC曲線中計(jì)算出一些其它的熱力學(xué)參數(shù)如協(xié)同性、熔融熵等。

對(duì)于具體的樣品和具體的反應(yīng)，根據(jù)一定的理論模型，人們還可以從DSC分析生物大分子結(jié)構(gòu)變化基礎(chǔ)

由于在給定溫度下每個(gè)體系總是趨向于達(dá)到自由能最小的狀態(tài)，所以樣品升溫或降溫的過程中，它可以轉(zhuǎn)變成具有不同自由能的另一種結(jié)構(gòu)狀態(tài)。分析伴隨著結(jié)構(gòu)變化所發(fā)生的焓變化，就可以得到樣品結(jié)構(gòu)變化的某些信息DSC分析生物大分子結(jié)構(gòu)變化基礎(chǔ)DSC在生物系統(tǒng)中的應(yīng)用近年來，由于高靈敏度熱分析儀器的出現(xiàn)，熱分析在生物學(xué)中的應(yīng)用得到很快的發(fā)展，所研究的樣品既有從脂、生物膜、蛋白質(zhì)到核酸等生物分子及其復(fù)合體系，也包括生物組織等混合物的系統(tǒng)。由于樣品的熱性質(zhì)和熱力學(xué)數(shù)據(jù)與它們的結(jié)構(gòu)的對(duì)應(yīng)關(guān)系，人們?？梢酝ㄟ^生物樣品的熱力學(xué)特性來了解其結(jié)構(gòu)的變化。下面我們不準(zhǔn)備系統(tǒng)介紹DSC在生物學(xué)中的應(yīng)用，只準(zhǔn)備用DSC在生物膜與蛋白質(zhì)研究中應(yīng)用的幾個(gè)例子來說明用DSC研究生物樣品的一些思路。

DSC在生物系統(tǒng)中的應(yīng)用生物膜與膜脂的研究生物膜是由膜脂、膜蛋白及少量多糖組成的一種薄膜結(jié)構(gòu)?？梢源致缘匕焉锬た闯墒窃诹鲃?dòng)的脂雙層中鑲嵌著膜蛋白的一種流體鑲嵌結(jié)構(gòu)。生物體系以生物膜將自己與外界環(huán)境分隔開來，同時(shí)又通過生物膜這個(gè)界面與外界聯(lián)系，進(jìn)行物質(zhì)、能量和信息的交換。各類生物大分子中，用DSC方法研究較早的是膜脂。生物膜與膜脂的研究?jī)H用少量樣品即可在很寬的溫度范圍內(nèi)連續(xù)測(cè)量，既省樣品又省時(shí)間，也不需要在樣品中添加任何標(biāo)記物，樣品的形態(tài)也可以多種多樣。用DSC可以測(cè)得膜脂及生物膜的相變溫度、相變焓、相變熵及相變協(xié)同參數(shù)等多種參數(shù)，所有與膜結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)的機(jī)理研究幾乎都可以從DSC測(cè)量中得到某些信息。DSC已經(jīng)成為生物膜研究中一種不可或缺的重要方法。僅用少量樣品即可在很寬的溫度范圍內(nèi)連續(xù)測(cè)量，既省樣品又省時(shí)間生物膜結(jié)構(gòu)的多型性是生物膜的一個(gè)重要特點(diǎn)，膜脂的組成不同，膜所處的環(huán)境溫度不同，膜中其它物質(zhì)如水、離子、多肽、蛋白質(zhì)或其它藥物分子的存在及其種類和數(shù)量的差別，都會(huì)對(duì)生物膜結(jié)構(gòu)造成影響。脂雙層結(jié)構(gòu)最常見的相態(tài)有凝膠相和液晶相。除了脂雙層結(jié)構(gòu)以外，膜脂還可能采取反向囊泡結(jié)構(gòu)和六角相結(jié)構(gòu)等不同的相態(tài)。生物膜結(jié)構(gòu)的多型性是生物膜的一個(gè)重要特點(diǎn)，膜脂的組成不同，膜不同相態(tài)下生物膜的物理性質(zhì)會(huì)有很明顯的差別，其中研究得最多的是膜流動(dòng)性。液晶相流動(dòng)性比凝膠相膜流動(dòng)性高，六角相比雙層結(jié)構(gòu)的膜流動(dòng)性高。膜脂從晶態(tài)轉(zhuǎn)變到液晶態(tài)的相變溫度越低，則膜的流動(dòng)性越高。膜結(jié)構(gòu)及膜流動(dòng)性對(duì)膜蛋白的結(jié)構(gòu)和功能都有影響。因此，生物膜處于什么相態(tài)對(duì)于生物膜的功能十分重要。對(duì)影響生物膜相態(tài)的各種因素也進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。下面將舉例介紹這方面研究的一些情況。不同相態(tài)下生物膜的物理性質(zhì)會(huì)有很明顯的差別，其中研究得最多的脂質(zhì)雙分子層膜的L

→L

相變是個(gè)吸熱過程，相變焓＝整個(gè)扭曲構(gòu)象(gauche)異構(gòu)化所需的能量＋破壞相鄰烴鏈之間的范得華力所需的能量＋磷脂頭部基團(tuán)周圍的有序溶劑的變性所需的能量。純脂的相變溫度與含水的脂是不同的，下圖給出了充分水化的DPPC的DSC曲線，水化DPPC在35℃處有一個(gè)小的吸熱峰，稱為前相變(pretransition)，其焓變?yōu)?.8kcalmol-1；在41℃有一個(gè)主要的面積較大的吸熱峰(主峰)，通常稱對(duì)應(yīng)于41℃的主峰的相變?yōu)橹飨嘧?maintransition)。

脂質(zhì)雙分子層膜的L→L相變是個(gè)吸熱過程，相變焓＝整個(gè)扭圖充分水化的DPPC(二棕櫚酰磷脂酰膽堿)的DSC曲線

圖充分水化的DPPC(二棕櫚酰磷脂酰膽堿)的DSC曲線X射線衍射研究表明，低于前相變溫度時(shí)，烴鏈完全伸展并傾斜，與雙分子層平面的法線成

角度，即呈L

相。

角隨溫度而變。前相變溫度時(shí)最小，膜結(jié)構(gòu)變?yōu)槎S單斜晶格(P

)，此時(shí)片層結(jié)構(gòu)為周期性波紋所變形，但烴鏈仍傾斜。達(dá)41℃時(shí)發(fā)生主相變，膜結(jié)構(gòu)返至一維片層結(jié)構(gòu)，呈L

相。

X射線衍射研究表明，低于前相變溫度時(shí)，烴鏈完全伸展并傾斜，與前相變可能和脂質(zhì)極性頭部有關(guān)．前相變時(shí)．脂質(zhì)頭部旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)、構(gòu)象重排。另一種解釋是和鏈的傾斜度改變有關(guān)。在PE磷脂中沒有觀察到前相變（對(duì)于PE，晶體相時(shí)，烴鏈垂直于膜法線，即為L(zhǎng)

相)，其原因可能是：(1)在觀察的溫度范圍內(nèi)，頭部基團(tuán)保持高度有序；(2)前相變和主相變溫度靠得很近；(3)烴鏈傾斜度未發(fā)生改變。

前相變可能和脂質(zhì)極性頭部有關(guān)．前相變時(shí)．脂質(zhì)頭部旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)圖不同含水量的DSPC的DSC曲線

例.含水量對(duì)DSPC相變溫度的影響右圖所示的是含水量(圖中用C表示樣品中水的重量比)對(duì)DSPC(二硬脂酰磷脂酰膽堿，一種磷脂)的DSC曲線的影響。最上面的是脫水磷脂的DSC曲線，在77℃有一個(gè)單一的、較寬的相變峰。加水后，這一相變溫度降至57℃，峰也變得尖銳，表明水使磷脂變成疏松的液晶結(jié)構(gòu)，有協(xié)同的融解特性。一直到水分為20％(W/W)時(shí)仍是一個(gè)峰。圖中下面三條DSC曲線中。0℃處的峰對(duì)應(yīng)于冰的融解。由此，可以知道，1分子PC約和10分子水結(jié)合，此時(shí)即使低于0℃，水分仍不凍結(jié)，也就是說這部分水是結(jié)合水?？梢哉J(rèn)為它是膜結(jié)構(gòu)的一個(gè)組成成分。

圖不同含水量的DSPC的DSC曲線例.含水量對(duì)DSPC人們還測(cè)量了不同鏈長(zhǎng)飽和磷脂PC的DSC曲線。可以看出，鏈長(zhǎng)越短，相變溫度也越低。對(duì)pH值、Ca2+、蛋白質(zhì)和其它藥物對(duì)磷脂從液晶態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槟z態(tài)的相變溫度的影響也進(jìn)行了大量研究。膽固醇是哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜中的一種脂成分。對(duì)膽固醇在生物膜中的作用進(jìn)行了大量研究。用最簡(jiǎn)單的DSC測(cè)量就可以看出：在二棕櫚酰磷脂酰膽堿這種磷脂中加入膽固醇，其相變溫度和相變熱焓都有所降低。

人們還測(cè)量了不同鏈長(zhǎng)飽和磷脂PC的DSC曲線。可以看出，鏈長(zhǎng)還有人用DSC測(cè)定了抗菌素、抗抑制劑、抗麻醉劑和抗鎮(zhèn)靜劑等藥物對(duì)膜脂相變的影響。通過這些研究，可了解藥物誘發(fā)生物膜結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化的分子機(jī)理。例如，曾有人對(duì)各種嗎啡衍生物對(duì)水合二棕櫚酰磷脂酰膽堿相變溫度的影響進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：磷脂的相變溫度隨嗎啡衍生物側(cè)基上的烷基鏈長(zhǎng)度下降而降低。

上面介紹的工作多是用某些生物膜中的脂質(zhì)成分構(gòu)建的模型膜體系進(jìn)行的，也有不少天然生物膜的DSC研究結(jié)果。

還有人用DSC測(cè)定了抗菌素、抗抑制劑、抗麻醉劑和抗鎮(zhèn)靜劑等藥對(duì)一種具有自身增殖能力的最小的微生物萊氏支原體膜和紅細(xì)胞膜進(jìn)行的DSC研究是比較具有代表性的生物膜DSC早期研究工作。有人測(cè)定了整個(gè)萊氏支原體細(xì)胞、細(xì)胞膜和細(xì)胞膜抽提脂的DSC曲線，并確定其中第一個(gè)吸熱峰（20

40℃）是脂的相變吸熱峰，第二個(gè)吸熱峰（50

70℃）是膜蛋白變性峰。對(duì)一種具有自身增殖能力的最小的微生物萊氏支原體膜和紅細(xì)胞膜進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜含多種脂成分，包括膽固醇，膽固醇及各種其它脂的相互作用會(huì)改變各膜脂相變峰的峰位、峰寬和峰高，使不同脂的相變峰變得不再尖銳，因此要檢測(cè)出細(xì)胞膜內(nèi)混合膜脂中各個(gè)脂成分的相變峰一般比較困難，但有些細(xì)胞膜膜脂的DSC仍有一定的特征峰，根據(jù)細(xì)胞膜脂與其它物質(zhì)如藥物的相互作用對(duì)其DSC的影響，仍可以得到許多重要信息。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜含多種脂成分，包括膽固醇，膽固醇及各種其它脂的蛋白質(zhì)的DSC研究

雖然研究生物大分子結(jié)構(gòu)的方法很多，但是DSC仍可給出一些與其它方法不同的信息。例如，蛋白質(zhì)熱變性過程中用DSC測(cè)定與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化有關(guān)的熱效應(yīng)，可以分析其結(jié)構(gòu)變化過程，還可以研究影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的各種因素。早期對(duì)蛋白質(zhì)的研究許多都是沿這種思路進(jìn)行的。

蛋白質(zhì)的DSC研究

蛋白質(zhì)熱變性過程中用DSC測(cè)定與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化有關(guān)的熱效應(yīng)，提供與蛋白質(zhì)熱變性有關(guān)的大量信息，如：蛋白質(zhì)的空間構(gòu)想的變化、熱穩(wěn)定性、熱變性的原因；熱變性動(dòng)力學(xué)、熱穩(wěn)定性與生理活性的關(guān)系等蛋白質(zhì)熱變性過程中用DSC測(cè)定與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化有關(guān)的熱

在熱變性過程中，蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象可能變化，如鏈的伸展或折疊、基團(tuán)的重組等，相應(yīng)地可能會(huì)引起蛋白質(zhì)生理活性改變。DSC可以跟蹤考察蛋白質(zhì)的熱變性對(duì)其生理活性的影響，獲得其空間構(gòu)象方面的大量信息，有效指導(dǎo)制劑的研究與設(shè)計(jì)提供影響。目前已有一些關(guān)于分子量較小的蛋白質(zhì)熱變性的DSC測(cè)定報(bào)道，其中包括對(duì)已知空間結(jié)構(gòu)的核糖核酸酶、溶菌酶、肌球蛋白和細(xì)胞色素C等的熱變性研究。測(cè)得這類蛋白質(zhì)的穩(wěn)定能約為40~80kJ/mol，與理論計(jì)算值相吻合

在熱變性過程中，蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象可能變化，如鏈的伸展或早期對(duì)許多蛋白質(zhì)的DSC研究是關(guān)于溶劑環(huán)境對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響，例加有人用DSC研究了溶菌酶在pH=2的甲醇、乙醇和丙醇水溶液中的熱變性，比較了溶菌酶在不同濃度的丙醇水溶液中的DSC曲線。研究表明：醇類可通過它的親水能力破壞蛋白質(zhì)周圍水的結(jié)構(gòu)，從而降低了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。早期對(duì)許多蛋白質(zhì)的DSC研究是關(guān)于溶劑環(huán)境對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影研究金屬離子對(duì)堿活性磷酸酶轉(zhuǎn)變的影響，DSC曲線顯示：金屬離子能使酶的熱穩(wěn)定增大；隨著金屬離子濃度的增加，酶的熱穩(wěn)定性增大。研究蔗糖對(duì)凝乳蛋白酶轉(zhuǎn)變溫度和轉(zhuǎn)變熱焓的影響。并推測(cè)：蔗糖改變了蛋白質(zhì)的溶劑環(huán)境，增加蔗糖濃度可使蛋白質(zhì)的螺旋結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定，變性峰移向較高溫度。在一定的高蔗糖濃度和升溫速率下，變性峰可分離成兩個(gè)峰。隨著DSC儀器靈敏度和穩(wěn)定性的提高，對(duì)蛋白質(zhì)的DSC研究也越來越深入。研究金屬離子對(duì)堿活性磷酸酶轉(zhuǎn)變的影響，DSC曲線顯示：金屬離RNase的重組S—肽與S—蛋白質(zhì)的相互結(jié)合作用是特異性，當(dāng)摩爾比r＝[S—肽]/[S—蛋白質(zhì)]等于或稍大于這兩部分完全再結(jié)合所需值時(shí)，將導(dǎo)致RNase的重組。下圖是不同r值的S—肽與S—蛋白質(zhì)的DSC曲線，可以看出高溫峰的高度（代表重組RNase的變性）明顯隨r值的增大而變大

RNase的重組S—肽與S—蛋白質(zhì)的相互結(jié)合作用是特

S—肽與S—蛋白質(zhì)的特異性相互結(jié)合作用

S—肽與S—蛋白質(zhì)的特異性相互結(jié)合作用

蛋白質(zhì)折疊的熱變性研究溫度變化會(huì)對(duì)生物大分子的結(jié)構(gòu)造成擾動(dòng)，可引起生物大分子結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變。在一定的溫度下，不同結(jié)構(gòu)的生物大分子會(huì)達(dá)到某種平衡狀態(tài)，這種平衡狀態(tài)隨溫度的變化可以提供關(guān)于Gibbs自由能的各種參數(shù)，如焓、熵、熱容量等信息。由于DSC可以提供這類信息，因此它也提供了一種確定蛋白質(zhì)折疊和去折疊轉(zhuǎn)變的能力學(xué)和熱力學(xué)的可能性。蛋白質(zhì)折疊的熱變性研究ThermochimicaActa409(2004)137–144Differentialscanningcalorimetricstudyofthemoltenglobulestateofcytochromecinducedbysodiumn-dodecylsulfateAbstractThemoltenglobule(MG)state,acompactdenaturedstatewithasignificantlynative-likesecondarystructurebutalargelyflexibleanddisorderedtertiarystructure,hasbeenproposedtobeamajorintermediateofproteinfolding.ToexploreanotherapproachforcharacterizingtheMGstate,sodiumdodecylsulfate(SDS)inducedformationoftheMGstateofhorsecytochromecatpH2wasstudiedbycirculardichroism,visiblespectroscopy,isothermaltitrationcalorimetry(ITC)anddifferentialscanningcalorimetry(DSC).ThesetechniquesconfirmedthattheadditionofSDStoacid-unfoldedstateofcytochromecinducedtheMGstate.Although,theDSCthermaldenaturationofcytochromecwasalwayscalorimetricallyirreversible,theMGstateinducedbySDSatlowconcentrationsshowedareversibleprofile.ThespectroscopicpropertiesdemonstratedthatthehydrophobictailofSDSutilizedthehydrophobiccontributiontostabilizingthehemeconformationatMGstateincytochromec.ThiswouldbethemainreasonofthermalprofilereversibilityofMGstateincytochromec.ThereversibilityofDSCthermogramwouldallowitsdeconvolutionandanalysisoftheenergeticdomainsforthisprotein.ThermochimicaActa409(2004)Fig.1.(A)Far-UVCDspectraofcytochromecasafunctionofSDSconcentrationatpH2and20℃.0mMSDS(denaturedstate);0.01mMSDS;0.037mMSDS;0.06mMSDS;0.08mMSDS.Basedontheellipticityvaluesat222nm,thehelicalcontentoftheMG-likestateofcytochromecinducedby0.08mMSDSis33.57%,thehelicalcontentsoftheunfoldedstateandthenativestateofcytochromecare4and30%,respectively.Fig.1.(A)Far-UVCDspeFig.1BshowsthechangesfromtheunfoldedstatetotheMGstateastheresultoftheadditionofcorrespondingconcentrationofSDSinFig.1.Itisapparentthattherightshiftofwavelengthisaccompaniedwithintensitydecreases;whichindicatesthepresenceofMGstatefortheprotein.Fig.1BSoretabsorptionspectraofcytochromecasafunctionofSDSconcentrationsatpH2and20℃.0mMSDS(denaturedstate);0.02mMSDS;0.04mMSDS;0.06mMSDS;0.07mMSDS;0.08mMSDS.Dashedlineshowsthenativestatein25mMphosphatebufferatpH7.Proteinconcentrationwas5μM.Fig.1BshowsthechangesfroFig.2.Absorptionspectraofheme(a);(1)apocytochromecinteractedwithheme(heme–apocytochromeccomplex);(2)SDS(0.02mM)interactedwithheme–apocytochromeccomplex;(3)SDS(0.04mM);(4)SDS(0.06mM);(5)SDS(0.08mM).DottedcurveshowstheMGstatethatwasinducedwithadditionof0.08mMSDStoholocytochr