生化討論課課件

李涵喬羅忠育湯不器P53基因表達檢測—RT-PCR李涵喬羅忠育湯不器P53基因表達檢測—RT-PCR1實驗目的根據(jù)GenBank中P53基因的部分序列(GenBank登錄號:AH007667.2)，設計引物，確定RT-PCR的參數(shù)，檢測P53基因在血細胞中的表達情況。實驗目的根據(jù)GenBank中P53基因的部分序列(GenBa2CONTENTS0203在Genbank中查找p53基因04反轉錄的引物05PCR參數(shù)設定目錄01檢測p53基因的表達基因表達的檢測方法CONTENTS0203在Genbank中查找p53基因04301基因檢測的方法01基因檢測的方法4基因檢測的方法在蛋白質水平在DNA水平在mrna水平Northern印記雜交RT-PCR.......基因檢測的方法在蛋白質水平在DNA水平在mrna水平Nort5mRNA水平上ReverseTranscriptionPCR

RNA提取cDNA反轉錄PCRNorthern印記雜交Northern印記雜交基因表達水平mRNA水平上ReverseTranscriptionP6RT-PCRRT-PCR(反轉錄PCR技術)RNA的反轉錄（reversetranscription）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結合的技術。其原理是先在反轉錄酶的作用下，以mRNA為模板合成cDNA，再以此cDNA為模版進行PCR反應低豐度的mRNA通過RT-PCR得以擴增，便于檢測RT-PCRRT-PCR(反轉錄PCR技術)RN7123

隨機六聚體引物：用此種方法時，體系中所有RNA分子全部充當了cDNA第一鏈模板，PCR引物在擴增過程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中96%來源于rRNA。特異性引物：用含目標RNA的互補序列的寡核苷酸作為引物，用此類引物僅產(chǎn)生所需要的cDNA，導致更為特異的PCR擴增。RT-PCR所用的引物

Oligo(dT)：是一種對mRNA特異的方法。因絕大多數(shù)真核細胞mRNA具有3’端Poly(A)尾，此引物與其配對，僅mRNA可被轉錄，特異地將mRNA從總RNA中分離出來123隨機六聚體引物：用此種方法時，體系中所有RNA分子全802在Genbank中查找p53基因02在Genbank中查找p53基因9查找p53基因序列使用genbank，p53登陸號AH007667.2/genbank查找p53基因序列使用genbank，p53登陸號AH00710生化討論課ppt課件11生化討論課ppt課件12生化討論課ppt課件13生化討論課ppt課件1403引物設計03引物設計1515263748引物應用核酸系列保守區(qū)內設計并具有特異性產(chǎn)物不能形成二級結構引物長度一般在15~30堿基之間G+C含量在40%~60%之間堿基要隨機分布引物自身及之間不能有連續(xù)4個堿基的互補引物5′端可以修飾引物3’端不可修飾引物3′端要避開密碼子的第3位引物設計的原則15263748引物應用核酸系列保守區(qū)內設計并具有特異性產(chǎn)物16Primerpremier5.0Primer

Premier5.0是由加拿大的Premier公司開發(fā)的專業(yè)用于PCR或測序引物以及雜交探針的設計、評估的軟件，其主要界面分為序列編輯窗口（Genetank），引物設計窗口（Primer

Design），酶切分析窗口（Restriction

Sites）和紋基分析窗口（Motif），這里我們主要介紹其引物設計功能。引物設計Primerpremier5.0Primer

Premi17啟動界面引物設計啟動界面引物設計18在此輸入需擴增的DNA序列引物設計在此輸入需擴增的DNA序列引物設計19引物設計引物設計20引物設計引物設計21引物設計引物設計22引物設計引物設計23引物設計引物設計24Hairpin：發(fā)夾結構Dimer：二聚體FalsePriming：錯配CrossDimer：交叉二聚體引物設計Hairpin：發(fā)夾結構引物設計25引物設計引物設計26引物設計引物設計27保存選擇滿意的引物引物設計保存選擇滿意的引物引物設計28所選引物引物設計所選引物引物設計2904確定RT-PCR的參數(shù)04確定RT-PCR的參數(shù)30確定RT-PCR的參數(shù)確定四項參數(shù)循環(huán)次數(shù)27次延伸溫度和時間73度60秒退火溫度和時間55度45秒變性溫度和時間94度30秒變性退火循環(huán)次數(shù)延伸確定RT-PCR的參數(shù)確定四項參數(shù)循環(huán)次數(shù)延伸溫度和時間退火31確定RT-PCR的參數(shù)一、變性溫度和時間變性：cDNA在較高溫度下（93-98℃）由雙鏈變性解鏈成單鏈，有利于與引物結合。溫度與時間：預變性95℃1min變性95℃30s或97℃15s（變性不完全，DNA雙鏈會很快復性，因而減少產(chǎn)量。在變性中，溫度太高或反應時間過長，會導致酶活性的損失。）模板DNA變性不充分是PCR失敗的主要原因。確定RT-PCR的參數(shù)一、變性溫度和時間變性：cDNA在較高32確定RT-PCR的參數(shù)二、退火溫度和時間退火：變性的DNA單鏈快速冷卻至（37-65℃）使引物與DNA單鏈結合。退火溫度決定PCR的特異性（增加退火溫度會增加引物的識別，同時可降低引物3端核苷酸的錯誤延伸。）而引物退火溫度和所需時間長短取決于反應體系中的基本組成及擴增引物的長度和濃度。

退火時間：30～60s退火溫度：比擴增引物的Tm值低5℃確定RT-PCR的參數(shù)二、退火溫度和時間退火：變性的DNA單33確定RT-PCR的參數(shù)三、延伸溫度與時間

引物延伸溫度一般為72℃（70-75℃），此時TaqDNA聚合酶活性最高不合適的延伸溫度不僅會影響擴增產(chǎn)物的特異性,亦會影響其產(chǎn)量。延伸的時間決定于擴增模板的長度，小于1kb的片段一般1min左右，而10kb的片段可能需要15min或更長時間。確定RT-PCR的參數(shù)三、延伸溫度與時間

引物延伸溫度一般為34確定RT-PCR的參數(shù)四、循環(huán)次數(shù)

理論上20-25個循環(huán)后，擴增DNA產(chǎn)物累計可達最大值，實際操作中25-30較合理。需要進一步增加產(chǎn)量時，可將第一次PCR產(chǎn)物稀釋后再擴增，而不要盲目增加循環(huán)數(shù)，以免增加非特異擴增。確定RT-PCR的參數(shù)四、循環(huán)次數(shù)

理論上20-25個循環(huán)后35確定RT-PCR的參數(shù)常用底物濃度Taq聚合酶濃度1.0-2.5U/100μL引物濃度0.1-0.5μmol/LdNTP的濃度20-200μmol/LMg離子濃度0.5-2.5mmol/L四、確定反應底物濃度

確定RT-PCR的參數(shù)常用底物濃度Taq聚合酶濃度1.0-23605檢測p53基因的表達05檢測p53基因的表達37出現(xiàn)的原因以及解決方法1.假陽性：常常由于實驗材料的嚙齒類動物p53基因為突變型2.出現(xiàn)非特異性擴增帶：一旦出現(xiàn)了非特異性擴增，就考慮及時更換引物，或者采取高溫退火等措施3.假陰性：少加了東西或者酶失活了，或退火溫度太高，模板質量問題等，解決辦法就是檢查是否少加東西降低退火溫度或者做個梯度，可以相應提高鎂離子濃度，仍然失敗后可以考慮二次PCR?；虮磉_檢測出現(xiàn)的原因以及解決方法1.假陽性：常常由于實驗材料的嚙齒類動38電泳結果分析1.Marker（DNA分子量標準）2.cDNA3.假陽性對照（出現(xiàn)的PCR擴增條帶一致，有時更整齊更明亮）4.假陰性對照（什么條帶沒有）

1234基因表達檢測電泳結果分析1.Marker（DNA分子量標準）139常見異常結果1.假陽性：出現(xiàn)的條帶數(shù)與目的靶序列條帶一致，有時其他條帶更整齊，亮度更高2.出現(xiàn)非特異性擴增帶：PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶3.假陰性：什么條帶都不出現(xiàn)基因表達檢測常見異常結果1.假陽性：出現(xiàn)的條帶數(shù)與目的靶序列條帶一致，有40出現(xiàn)的原因以及解決方法1.假陽性：常常由于實驗材料的嚙齒類動物p53基因為突變型2.出