牡蠣酶解物對慢性酒精性肝損傷小鼠的保肝作用機(jī)制

牡蠣酶解物對慢性酒精性肝損傷小鼠的保肝作用機(jī)制

牡蠣是一種常見的海上無脊椎動(dòng)物，在福建、廣東、廣東、海南、山東等沿海地區(qū)廣泛分布。牡蠣在中國傳統(tǒng)醫(yī)藥學(xué)中有著重要的地位，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，牡蠣具有滋陰潛陽、鎮(zhèn)靜斂汗、固精止帶、化痰軟堅(jiān)的功效，與其它中草藥搭配熬制服用，可以治療眩暈、自汗、盜汗等疾病，且效果顯著肝臟在人體的新陳代謝中起著重要的作用。肝臟疾病主要是由病毒、過度飲酒和化學(xué)物質(zhì)等引起的。反復(fù)損傷性炎癥可導(dǎo)致肝炎、肝纖維化、肝硬化，甚至能使機(jī)體因肝衰竭而死亡本研究通過構(gòu)建慢性酒精性肝損傷小鼠模型，通過不同劑量水平的牡蠣酶解物干預(yù)慢性ALD小鼠，探究牡蠣酶解物對慢性ALD小鼠的血液和肝臟生化指標(biāo)的影響，并分析肝臟組織形態(tài)、關(guān)鍵基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平上的變化以及基于16SrRNA高通量測序技術(shù)研究牡蠣酶解物對慢性ALD小鼠腸道菌群的影響，來探究其保肝作用機(jī)制，以期為海洋生物資源的深加工及營養(yǎng)功能性食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1pcr和pcr擴(kuò)增清潔級（SPF）雄性KM小鼠福州吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；牡蠣（Oyster）福州市金山大潤發(fā)超市；中性蛋白酶Promega公司；RNAisoPlus、PrimeScriptTMRTreagentKit、gDNAEraser、SYBRPremixExTaqTMII寶生物工程有限公司；Phusion?High-FidelityPCRMasterMixwithGCBuffer、GeneJET膠回收試劑盒、IonPlusFragmentLibraryKit48rxns建庫試劑盒美國Sigma公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）試劑盒、谷胱甘肽（GSH）試劑盒、甘油三酯（TG）試劑盒、總膽汁酸（TBA）試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒南京建成生物工程研究所。1.2酶標(biāo)儀、熒光定量pcr法電子天平梅特勒-托利多儀器有限公司；酶標(biāo)儀、熒光定量PCR儀美國Thermo公司；光學(xué)顯微鏡卡爾·蔡司股份公司；PCR儀上海智巖科學(xué)儀器有限公司。1.3方法1.3.1牡蠣50%乙醇提取物和牡蠣65%乙醇提取物的制備將牡蠣洗凈磨成肉糜狀，分別用95%乙醇、55%乙醇和水提取得到濾液Ⅰ、濾液Ⅱ和濾液Ⅲ，經(jīng)濃縮和冷凍干燥，分別得牡蠣95%乙醇提取物（OY95）、牡蠣55%乙醇提取物（OY55）和牡蠣水提取物（OYWE）。取水提剩余物殘?jiān)?，加入十倍體積的去離子水，用1400U/g中性蛋白酶酶解（pH7，時(shí)間4h）得到濾液Ⅳ，經(jīng)濃縮和凍干后得牡蠣酶解物（OYEH）。1.3.2lc-ms分析稱取1mg牡蠣酶解物，溶于1mLLCMSbuffer，將牡蠣酶解物溶液樣品轉(zhuǎn)移至對應(yīng)的10kD的超濾管中，于4℃離心（12000×一維色譜分離的樣品經(jīng)離心干燥后，重新溶解于Nano-LC流動(dòng)相（A：0.1%甲酸，B:2%乙腈/水）中裝瓶上樣，進(jìn)行LC-MS分析。溶解后的樣品以3μL體積上樣到nanoViperC18預(yù)柱上（3μm，100?），然后保持流速沖洗脫鹽5min，液相為EasynLC1000納升液相系統(tǒng)，樣品脫鹽后再經(jīng)分析柱分離，分析柱規(guī)格是C18反相色譜柱。采用PEAKSStudio8.5（version8.5,BioinformaticsSolutionsInc.Waterloo,Canada）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)加工處理和檢索分析。1.3.3小鼠牡蠣酶解物灌胃實(shí)驗(yàn)小鼠經(jīng)過1周適應(yīng)性喂養(yǎng)期后，將其隨機(jī)分為以下四組，每組10只：正常組、模型組、牡蠣酶解物低劑量組（OYEL組）、牡蠣酶解物高劑量組（OYEH組）。連續(xù)灌胃給予牡蠣酶解物4周，每天上午9時(shí)給予各組小鼠灌胃，牡蠣酶解物實(shí)驗(yàn)組中的小鼠分別灌胃0.25mL高、低劑量牡蠣酶解物（溶于無菌蒸餾水中），高、低劑量分別為80mg/kg·day、40mg/kg·day，正常組、模型組給予等體積0.9%的生理鹽水。下午4時(shí)給予正常組0.9%生理鹽水，劑量為5mL/kg，給予模型組、OYEL、OYEH組小鼠50%乙醇灌胃，劑量為5mL/kg。末次灌胃后，各組小鼠隔夜禁食16小時(shí)后眼眶取血，頸椎脫臼處死小鼠。1.3.4小鼠肝組織中hyp的計(jì)算取小鼠肝臟稱重，肝臟指數(shù)按公式（小鼠肝臟指數(shù)=肝臟濕重/體重×100％）計(jì)算。用離心管收集小鼠血液，室溫靜置1h后3000×將9倍體積的生理鹽水加入肝組織中，并將肝組織在冰水浴中勻漿。將制備的勻漿在4℃下以2500×1.3.5肝組織形態(tài)分析取肝組織迅速置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋。經(jīng)常規(guī)脫蠟、脫水后做H＆E染色，通過40×顯微鏡放大拍照觀察肝組織形態(tài)。1.3.6mrna的轉(zhuǎn)錄水平從肝組織中提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用RT-qPCR測定TLR4、NF-κB、TNF-α的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。小鼠基因引物序列如表1所示。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)條件為95℃進(jìn)行30s，并進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95℃25s和60℃30s。通過Rotor-geneQ軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，通過21.3.716srna基因的高流量測量序列1.3.7.1.樣品預(yù)處理分別取正常組、模型組、OYEL組、OYEH組各六只小鼠的盲腸腸道內(nèi)容物2g，加入磷酸鹽緩沖溶液，反復(fù)清洗離心，取沉淀物。1.3.7.2.提取氨基酸化合物dna使用CTAB法對各組的DNA進(jìn)行提取，引物對應(yīng)區(qū)域?yàn)?6SV3-V4區(qū)。1.3.7.3-牡蠣酶解劑對大鼠腸道菌群的影響基于R語言，繪制影響酒精性肝損傷的生化指標(biāo)與屬水平上的腸道菌群的關(guān)聯(lián)熱圖，使用cytoscape3.6.1軟件繪制相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖。1.3.8數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析使用DPS6.50數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)和Excel對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用單因素方差分析（ANOVA）統(tǒng)計(jì)差異顯著性，以2結(jié)果與分析2.1牡蠣提取物的干重得率圖1表示了牡蠣4種提取物的干重得率，從圖中可以看出，牡蠣提取物的干重得率依次為：OY95（28.06%）>OYEH（21.72%）>OYWE（19.00%）>OY55（8.95%）。牡蠣提取物的總得率為77.73%。2.2oynh的多肽序列及豐度表2列出了牡蠣酶解物中主要多肽的序列。由表2可知，從0到30分鐘的不同保留時(shí)間中，OYEH主要有20個(gè)多肽序列。肽的豐度從高到低（前5）依次為：GHPGLPGDAGPEGPRGNPG、IDLGAVN、EHPVL、GPAGPIGPR、MFLGPQ。另外，圖2顯示了豐度為前5的肽的一級質(zhì)譜圖和二級質(zhì)譜圖。2.3小鼠體重、狀態(tài)及死亡數(shù)量的測定圖3為小鼠第1~4周體重變化柱狀圖。從圖中可以看出，在飼養(yǎng)第一周，各組間小鼠體重差異不顯著，2~4周正常組的體重高于其他組，在第二周后，OYEH組的體重高于OYEL組與模型組。通過4周的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，觀察并記錄了小鼠的外觀、行為及死亡數(shù)量。正常組毛發(fā)光亮緊湊，行動(dòng)靈活自如。模型組毛發(fā)暗淡無光，雜亂無章，且精神狀態(tài)渙散，給予酒精后有嗜睡現(xiàn)象。OYEL與OYEH組的情況較模型組有所改善。2.4大鼠血清生化指標(biāo)分析如圖4A、B所示，OYEH組的ALT、AST水平都顯著低于模型組（2.5肝組織形態(tài)分析從圖5A可以看出，模型組的肝臟指數(shù)極顯著高于正常組（小鼠肝臟組織的病理學(xué)切片如圖6所示。從圖6a可以看出，正常組的肝細(xì)胞較完整，無細(xì)胞破裂、自溶或壞死的現(xiàn)象，分布均勻，肝細(xì)胞呈規(guī)則的球狀。在圖6b中，在肝小葉周圍的細(xì)胞消融嚴(yán)重，且肝小葉中有溶血的情況，細(xì)胞分裂嚴(yán)重。細(xì)胞形狀不規(guī)則，出現(xiàn)皺縮，大小出現(xiàn)差別。肝細(xì)胞之間的邊緣模糊，有一定的脂肪空泡。由圖6c和圖6d可以看出，OYEL與OYEH干預(yù)后，相對于模型組，細(xì)胞的溶血情況有一定的改善，其中OYEH組呈現(xiàn)出最接近正常組的狀態(tài)。2.6mtna轉(zhuǎn)錄水平牡蠣酶解物對慢性ALD小鼠肝臟中TLR4、NF-κB和TNF-α基因在mRNA轉(zhuǎn)錄水平上的影響如圖7所示。在圖7中，與正常組相比，模型組小鼠肝臟TLR4、NF-κB和TNF-α基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平都顯著升高（2.7大鼠腸道菌群多樣性與生化指標(biāo)之間的相關(guān)性分析2.7.1各門地位類分析用OYEH飲食干預(yù)小鼠4周后，測定正常組、模型組、OYEL組和OYEH組小鼠腸道菌群的相對豐度，結(jié)果顯示，各組在門水平上的主要優(yōu)勢門類為厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes），其余菌門相對豐度較低（圖8）。與正常組相比，模型組的厚壁菌門相對豐度顯著降低（選擇屬水平上豐度前3的物種，圖9可知，在屬水平上的優(yōu)勢菌屬主要有2.7.2小鼠腸道菌群與慢性酒精性肝損傷生化指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性分析在屬水平上選擇豐度在前30的物種，基于Spearman相關(guān)檢驗(yàn)r指數(shù)分析，研究屬水平下小鼠腸道菌群與影響慢性酒精性肝損傷參數(shù)之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性，如圖10所示，在各組中富集的3酒精性肝損傷小鼠腸道菌群的變化牡蠣中含有豐富的生物活性物質(zhì)，以牡蠣為原料，對其中活性成分依次進(jìn)行提取和制備，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究牡蠣酶解物對慢性酒精性肝損傷的保護(hù)作用，并結(jié)合腸道菌群分析其保肝的作用機(jī)制。肝臟是酒精代謝的主要器官，機(jī)體攝入的酒精過多會導(dǎo)致不同程度的肝損傷。ALD的發(fā)病機(jī)制與乙醇及其代謝物對肝臟的毒性