污水廠養(yǎng)殖池中好氧反硝化微生物的分離、鑒定及功能篩選

污水廠養(yǎng)殖池中好氧反硝化微生物的分離、鑒定及功能篩選

0污水反硝化技術(shù)亞硝酸鹽是影響水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水和生活廢水的主要有毒物質(zhì)。較高濃度的亞硝酸鹽對(duì)動(dòng)物和人均有致死作用,即使在安全濃度范圍內(nèi)也會(huì)對(duì)動(dòng)物體和人體的抗病力及生理功能產(chǎn)生不良影響。水體中,氮以-3至+5九種不同價(jià)態(tài)形式存在,在生物及非生物因素的共同作用下,各種價(jià)態(tài)形式的氮在水體內(nèi)不斷遷移轉(zhuǎn)化,形成一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)循環(huán)目前污水反硝化處理技術(shù)包括物理法、化學(xué)法及生物反硝化法。其中,物理、化學(xué)法操作復(fù)雜,需要增加設(shè)備投資額,運(yùn)行成本高。同時(shí)該方法對(duì)有機(jī)物去除效率低,會(huì)造成二次污染,因此在實(shí)際運(yùn)用中存在一定的局限性。近年來,人們開始嘗試?yán)梦⑸?、植物或其他生物自身具有的功能消除或改變污染物存在形態(tài),達(dá)到降低污染物毒性的目的1材料和方法1.1反硝化微生物2013年8~9月分別從廈門筼簹污水處理廠和前埔污水處理廠初沉池、避風(fēng)塢海水排污口、海洋三所污水池、漳浦對(duì)蝦養(yǎng)殖池采集污水和污泥樣品進(jìn)行反硝化微生物的富集。1.2培養(yǎng)基的制備富集培養(yǎng)基:葡萄糖5g,乙酸鈉1g,檸檬酸鈉2.5g,NaCl30g,KH分離培養(yǎng)基:以MarineAgar(MA)和216LB固體培養(yǎng)基(硝酸銨0.2g,乙酸鈉1g,檸檬酸鈉0.5g,蛋白胨10g,酵母粉2g,NaCl30g,瓊脂粉15g,加超純水至1L,調(diào)pH7.5,121℃高壓蒸汽滅菌20min)作為分離培養(yǎng)基。1.3菌株純化及驗(yàn)證富集馴化:取10g污泥/污水樣品接種于150mL液體富集培養(yǎng)基中,在28℃、轉(zhuǎn)速為160r·min菌種分離、純化:富集培養(yǎng)后,取一定量富集培養(yǎng)液采用梯度稀釋平板劃線法,在MA或216LB固體培養(yǎng)基上涂板分離純化單菌。純化完全后保種并進(jìn)行反硝化效果驗(yàn)證。每個(gè)菌株的編號(hào)前面均由兩個(gè)字母組成,以硝酸鹽為唯一氮源分離的菌株編號(hào)以X開頭,以亞硝酸鹽為唯一氮源分離的菌株編號(hào)為Y開頭。第二個(gè)字母代表分離生境,Y、Q、D、P、T1、T2及T3分別代表分離自筼筜污水處理廠、前埔污水處理廠、海洋三所污水池、避風(fēng)塢排污口和漳浦對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)的1號(hào)、2號(hào)及3號(hào)養(yǎng)殖池。1.4srrna基因擴(kuò)增16SrRNA基因測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育分析:用TIANGEN試劑盒提取單菌基因組DNA,進(jìn)行16SrRNA基因擴(kuò)增。16SrRNA基因擴(kuò)增正向引物:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(位于E.coli16SrRNA基因的第8~27個(gè)堿基位置);反向引物:5′-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3′(位于E.coli16SrRNA基因的第1512~1493個(gè)堿基位置)1.5單帶反硝化效果的驗(yàn)證對(duì)分離純化的單菌進(jìn)行反硝化功能初篩,初篩培養(yǎng)基成分和富集培養(yǎng)基相同,培養(yǎng)基初始的NO復(fù)篩培養(yǎng)基初始的NO檢測(cè)分析方法:NO2結(jié)果與分析2.1不同生境來源樣品中的單菌以NaNO5個(gè)不同生境來源的樣品微生物組成差異較大,其中,從前埔污水處理廠樣品富集分離獲得20株單菌,包括鹽單胞菌屬(7/20)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium,2/20)、芽胞桿菌屬(2/20)、海桿菌屬(2/20)、海源菌屬(1/20)、放線菌屬(Aeromicrobium,1/20)、別樣海源菌屬(1/20)、短桿菌屬(Brevibacterium,1/20)、迪茨菌屬(Dietzia,1/20)(1/20)、副球菌屬(Paracoccus,1/20)和海洋桿菌屬(Pelagibacterium,1/20);筼筜污水處理廠樣品分離獲得18株單菌,包括鹽單胞菌屬(7/18)、微桿菌屬(Microbacterium,2/18)、棒狀桿菌屬(1/18)、海桿菌屬(1/18)、海源菌屬(1/18)、別樣海源菌屬(1/18)、迪茨菌屬(1/18)、假單胞菌屬(1/18)、嗜冷菌(Psychrobacter,1/18)、Rehaibacterium(1/18)和斯塔普氏菌屬(Stappia,1/18);漳浦對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)的3口養(yǎng)殖池共分離獲得64株單菌,主要包括鹽單胞菌屬(12/64)、芽胞桿菌屬(10/64)、假單胞菌屬(7/64),其次為海源菌屬(4/64)、副球菌屬(3/64)、節(jié)桿菌屬(Arthrobactor,3/64)、微桿菌屬(2/64)、Alishewanella(2/64)、紅細(xì)菌屬(Rhodobacter,2/64)、放線菌屬(1/64)、壤霉菌屬(Agromyces,1/64)(1/64)、別樣海源菌(1/64)、Belliella(1/64)、Brachybacterium(1/64)、德沃斯氏菌(Devosia,1/64)(1/64)、Fontibacter(1/64)、喜鹽芽胞桿菌(Halobacillus,1/64)、咸海鮮芽胞桿菌(Jeotgalibacillus,1/64)、溶桿菌(Lysobacter,1/64)、海桿菌(1/64)、中間根瘤菌(Mesorhizobium,1/64)、大洋單胞菌(Oceanimonas,1/64)、海洋桿菌(1/64)、發(fā)光細(xì)菌(Photobacterium,1/64)、鞘氨醇桿菌(Sphingobacterium,1/64)、斯塔普氏菌(1/64)、弧菌(Vibrio,1/64)和卓貝爾菌(Zobellella,1/64);避風(fēng)塢排污口樣品分離獲得14株單菌,包括鹽單胞菌(7/14)、別樣海源菌(2/14)、芽胞桿菌(1/20)、海桿菌(1/20)、Arenibacter(1/20)、圓桿菌(Cyclobacterium,1/20)、維諾格拉斯基氏菌(Winogradskyella,1/20);污水池樣品中富集分離獲得12株單菌,包括鹽單胞菌(6/12)、芽胞桿菌(3/12)、海源菌(2/12)和海桿菌(1/12)。盡管不同生境來源樣品富集分離的單菌存在較大差異,但有些種屬?gòu)V泛存在于各個(gè)不同生境中。其中γ-變形菌綱的鹽單胞菌屬占絕對(duì)優(yōu)勢(shì),廣泛存在于所有生境來源的樣品中,且均為各個(gè)富集樣品中的優(yōu)勢(shì)菌。本研究中共富集分離獲得40株鹽單胞菌,占總菌數(shù)的29.7%。40株單菌的16SrRNA基因與模式菌序列相似性在97.4%~99.7%,分布在15個(gè)不同的種,多樣性很豐富,主要包括大慶鹽單胞(Halomonasdaqingensis)、Halomonasalkaliantarctica、坎帕尼亞鹽單胞菌(Halomonascampaniensis)、熱水管鹽單胞菌(Halomonashydrothermalis)、Halomonasjohnsonia、Halomonasmongoliensis等菌株。芽胞桿菌屬是僅次于鹽單胞菌屬的優(yōu)勢(shì)菌。除了筼筜污水處理廠采集的樣品中沒分離到以外,其他樣品中均有分離獲得。通過形態(tài)篩選、測(cè)序分析及剔除重復(fù)共獲得16株不同樣品來源的單菌。這些單菌分布在12個(gè)種,多樣性豐富,與模式種的16SrRNA基因相似性在97.5%~100%之間。此外,本研究共分離獲得8株假單胞菌,分屬于7個(gè)種,其中在對(duì)蝦養(yǎng)殖池的三個(gè)樣品中共分離獲得了7株假單胞菌,分布在6個(gè)種。海源菌屬在本研究中也屬于較為優(yōu)勢(shì)的菌屬之一,共分離獲得8株菌,分屬于5個(gè)種,該屬?gòu)V泛分布于養(yǎng)殖場(chǎng)、污水處理廠、污水池等生境中。同時(shí)本研究還分離獲得6株海桿菌屬的單菌,與模式種16SrRNA基因相似性在97.19%~99.85%之間。其中在污水處理廠樣品中分離獲得5株,在養(yǎng)殖池中僅獲得1株。別樣海源菌為本研究中另一分布較廣的菌屬,從排污口、污水處理廠、養(yǎng)殖池共分離獲得5株菌。上述各個(gè)菌屬在本研究采集的樣品中分布較廣。此外,從每個(gè)污水樣品中亦分離獲得一些獨(dú)有菌株,如棒狀桿菌和迪茨菌,在本研究中僅在兩個(gè)污水處理廠的樣品中分離獲得,分別獲得3株和2株。從養(yǎng)殖池的三個(gè)樣品中各分離獲得1株煙草節(jié)桿菌(Arthrobacternicotianae),而在污水處理廠的樣品中未分離得到節(jié)桿菌。16SrRNA基因序列分析還表明,128株單菌中至少有24株潛在的新種,其中菌株XPN-3、XT1S-3、XY1-1、XT2-4與最近源模式種相似性低于95%,為潛在的新屬。XQ2-2-1、YQ2-4、YT1S-1a及YQ2-1-1A的16SrRNA序列與相應(yīng)模式菌相似性低于97%,另有16株菌的16SrRNA序列與相應(yīng)模式菌相似性在97%~98%,均為潛在的新種2.2主要微生物及微生物指標(biāo)以20mg·L16SrRNA序列分析結(jié)果表明,21株反硝化效果好的單菌與模式菌相似性為97.84%~100%,分屬于γ-變形菌綱、放線菌綱及α-變形菌綱等3個(gè)綱的6個(gè)屬,其中15株為鹽單胞菌屬,以大慶鹽單胞菌為主,其次為坎帕尼亞鹽單胞菌、嗜堿鹽單胞菌(H.alkaliphila)、玻利維亞鹽單胞菌(H.boliviensis)、H.salifodinae及H.johnsoniae。另外5株為:印度洋斯塔普氏菌(Stappiaindica)、煙草節(jié)桿菌、脫氮卓貝爾氏菌、Devosiachinhatensis及強(qiáng)酒海桿菌(Marinobactervinifirmus)。其中節(jié)桿菌、卓貝爾氏菌及海桿菌等屬作為好氧反硝化菌鮮有報(bào)道,而斯塔普氏菌屬細(xì)菌為首次報(bào)道具有好氧反硝化功能。卓貝爾氏菌YT1-8能在24h內(nèi)將100mg·L3單一氮源及微生物多樣性為了解不同環(huán)境樣品中好氧反硝化微生物的多樣性,并分離獲得這些微生物資源,本研究采集了污水處理廠、排污口、污水池、對(duì)蝦養(yǎng)殖池等不同生境來源的污水污泥樣品,進(jìn)行反硝化微生物的富集,獲得了128株可培養(yǎng)單菌。這128株單菌主要分布于6個(gè)綱38個(gè)屬,其中以γ-變形菌綱綱的鹽單胞菌、海源菌、海源菌和微桿菌,芽胞桿菌綱的芽胞桿菌屬為主。128株菌中有35株菌具有反硝化功能,反硝化效果較好的菌株主要為γ-變形菌綱的鹽單胞菌屬和卓貝爾氏菌屬。本研究有助于了解不同環(huán)境中反硝化微生物的分布和多樣性,同時(shí)為含氮廢水的生物修復(fù)提供菌種資源。氮源是生物生長(zhǎng)繁殖所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一。本研究分別以硝酸鹽和亞硝酸鹽為唯一氮源對(duì)污水處理廠、污水池、排污口及對(duì)蝦養(yǎng)殖池等5個(gè)不同生境來源的樣品進(jìn)行富集分離。不同生境對(duì)分離結(jié)果影響較大的樣品獲得的微生物組成差異較大,污水處理廠、對(duì)蝦養(yǎng)殖池的可培養(yǎng)微生物種屬較排污口和污水池豐富,獲得的可培養(yǎng)單菌數(shù)目較多。其中獲得種屬多樣性最豐富的樣品為對(duì)蝦養(yǎng)殖池3,共獲得27株單菌,分布在23個(gè)種;東區(qū)污水池樣品富集分離獲得的單菌數(shù)量少且種屬較單一,共獲得12株單菌,分布在4個(gè)屬的10個(gè)種。鹽單胞菌在本研究所涉及的所有樣品中均分離獲得;芽胞桿菌除了未在筼筜湖污水處理廠樣品中分離獲得外,在其他樣品中均廣泛存在;節(jié)桿菌和假單胞菌主要在養(yǎng)殖場(chǎng)分離獲得。此外,氮源的種類對(duì)富集結(jié)果也有一定影響。以硝酸鹽或亞硝酸鹽為唯一氮源富集分離的單菌各獲得22和21個(gè)屬的細(xì)菌,兩者分離結(jié)果多樣性相似。但各自也存在一些獨(dú)立菌株,如:放線菌、壤霉菌、Alishewanella、短桿菌、Cyclobacterium、德沃斯氏菌、迪茨菌、溶桿菌、海洋桿菌、發(fā)光桿菌、Rehaibacterium、鞘脂桿菌、斯塔普氏菌及弧菌等菌屬只在以硝酸鹽為唯一氮源時(shí)獲得,而別樣海源菌屬、不動(dòng)桿菌、Brachybacterium、棒狀桿菌、Fontibacter、Jeotgalibacillus、海單胞菌、副球菌、嗜冷菌、Winogradskyella及卓貝爾氏菌等菌屬僅在以亞硝酸鹽為唯一氮源時(shí)分離得到,表明氮源對(duì)反硝化微生物的種類具有一定的選擇性。微生物在氮循環(huán)中發(fā)揮著極為重要的作用。目前對(duì)土