園林植物育種學(xué)

第九章生物技術(shù)在園林植物遺傳改良中的應(yīng)用本章教學(xué)目的和要求.了解園林植物生物技術(shù)研究的主要內(nèi)容。.掌握植物組織培養(yǎng)、基因工程等技術(shù)在園林植物遺傳育種中的應(yīng)用。本章教學(xué)重點和難點重點：組織培養(yǎng)與基因工程在園林植物遺傳育種中的作用。難點：園林植物生物技術(shù)的原理與操作方法。教學(xué)內(nèi)容：生物技術(shù)（biotechnology）是指按照人們的意愿采取一定的技術(shù)手段，直接或間接地利用生物有機體（從微生物直至高等動植物）或其組成部分（器官、組織、細胞等），發(fā)展新的生產(chǎn)工藝，創(chuàng)造新的生物品種或生物制品的一種科學(xué)技術(shù)體系。包括組織培養(yǎng)、細胞工程、基因工程、發(fā)酵工程、蛋白質(zhì)工程等。第一節(jié)植物組織培養(yǎng)一、植物組織培養(yǎng)的相關(guān)概念植物組織培養(yǎng)（planttissueculture）：在無菌條件下，將離體的植物材料培養(yǎng)于人工培養(yǎng)基上，并給以適宜的培養(yǎng)條件，使之形成完整植株或生產(chǎn)出具有一定經(jīng)濟價值的生物產(chǎn)品的技術(shù)。包括分生組織、輸導(dǎo)組織、薄壁組織等離體組織，根、莖、葉、花、果實等各種器官，細胞、胚、胚珠、子房、胚乳等的離體培養(yǎng)。外植體（explant）:用于培養(yǎng)的離體材料。繼代培養(yǎng)（subculture）:由最初培養(yǎng)新增殖的組織，繼續(xù)轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的過程。無性繁殖系：由同一外植體反復(fù)進行繼代培養(yǎng)后，所得到的一系列無性繁殖后代。單細胞無性系：在細胞培養(yǎng)中，由單細胞形成的無性系。愈傷組織（callus）:在培養(yǎng)過程中，從植物各種器官、組織的外植體增殖而形成的一種無特定結(jié)構(gòu)和功能的細胞團。胚狀體(embryoid):由外植體或愈傷組織產(chǎn)生的，與正常受精卵發(fā)育方式類似的胚胎結(jié)構(gòu)體。二、 植物組織培養(yǎng)的基本程序.培養(yǎng)用具的準(zhǔn)備.培養(yǎng)基的制備基本成分(大量元素、微量元素、有機成分、鐵鹽)、碳源(蔗糖、葡萄糖等)、凝固劑(瓊脂、卡拉膠等)、植物生長調(diào)節(jié)劑(生長素、細胞分裂素等)、其他附加成分(活性炭、LH、CH、椰乳等)、pH值.外植體的選擇.接種(無菌操作).離體培養(yǎng)初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽分化(體胚再生)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)等培養(yǎng)條件、培養(yǎng)方式.煉苗移栽三、 植物組織培養(yǎng)的內(nèi)容.植株培養(yǎng).莖尖與分生組織培養(yǎng).胚培養(yǎng)(embryoculture).離體器官培養(yǎng)(organculture).花藥與花粉培養(yǎng)(anther&pollen).胚珠和子房培養(yǎng)(ovule&ovary).胚乳培養(yǎng)(endospermculture).細胞培養(yǎng)(cellculture).離體授粉受精(invitrofertilization)四、 植物組織培養(yǎng)在園林植物育種中的應(yīng)用快速繁殖植物品種、珍稀植物脫除病毒，培養(yǎng)無病毒苗木進行種質(zhì)資源的長期保存和遠距離運輸離體誘發(fā)和篩選突變體離體輻射或化學(xué)誘變；體細胞無性系變異的選擇獲得倍性不同的植株花藥（粉）培養(yǎng)獲得單倍體；胚乳培養(yǎng)獲得三倍體克服種子發(fā)育和萌發(fā)中的障礙蘭花種子萌發(fā)；胚搶救等克服遠緣雜交困難離體授粉受精提供育種中間材料第二節(jié)植物原生質(zhì)體培養(yǎng)與細胞融合一、 概念原生質(zhì)體：被去掉細胞壁的具有生活力的裸露細胞。原生質(zhì)體培養(yǎng)：將去掉了細胞壁的裸露細胞培養(yǎng)成植株的技術(shù)。原生質(zhì)體融合（細胞融合、體細胞雜交）：將不同種、甚至屬間細胞人工融合為雜種細胞，并使其再生成植株的技術(shù)。二、 原生質(zhì)體培養(yǎng)與細胞融合的方法步驟.原生質(zhì)體的制備獲得大量有活力的原生質(zhì)體。?原生質(zhì)體的分離機械分離法酶解分離法：分離材料的準(zhǔn)備（離體葉片、懸浮細胞等）酶解（果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶等）2）原生質(zhì)體的收集與純化過濾一離心法（沉淀法）漂浮法界面法）原生質(zhì)體的活力測定：形態(tài)、活性染色、熒光染料活性染色等方法影響原生質(zhì)體活力的因素:?分離材料的生理狀態(tài)-酶解條件：酶質(zhì)量、濃度、酶解溫度、酶解時間、酶溶液的滲透壓分離條件：離心次數(shù)、離心速度、純化方法、分離持續(xù)時間環(huán)境條件：操作環(huán)境的溫度、分離用具的影響.原生質(zhì)體的培養(yǎng)培養(yǎng)原生質(zhì)體的基本營養(yǎng)同一般組培;對某些組分，如鈣和碳源的水平要求更為嚴格。在培養(yǎng)基中保持一定的滲透壓極為重要。常用的培養(yǎng)基有：MS培養(yǎng)基、N-T培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基等。注意原生質(zhì)的濕度及培養(yǎng)時的溫度和光照。培養(yǎng)方法：固體培養(yǎng)法；淺層液體培養(yǎng)法；雙層培養(yǎng)法.細胞融合）原生質(zhì)體融合PEG法、電融合法、高pH一高濃度鈣離子法、NaNO3法等；2） 雜種細胞的篩選突變細胞遺傳互補選擇法營養(yǎng)互補選擇法根據(jù)原生質(zhì)體特性差異的機械選擇法3） 體細胞雜種植株的鑒定形態(tài)學(xué)方法、細胞學(xué)方法，同工酶法，分子標(biāo)記法等。融合體的類型：對稱融合非對稱融合三、原生質(zhì)體操作在育種中的應(yīng)用培育新品種創(chuàng)造新種質(zhì)克服遠緣雜交不親和、雜交不育等障礙作為基因工程的良好受體進行突變體篩選的優(yōu)良原始材料第三節(jié)植物基因工程一、 植物基因工程的概念及其研究概況植物基因工程（plantgeneticengineering）是指按照人們的意志，通過一定的程序，將具有遺傳信息的DNA片段，在離體條件下，用工具酶加以剪切、組合和拼接，再將人工重組的基因，引入適當(dāng)?shù)闹参锸荏w中進行復(fù)制和表達的技術(shù)。1972年，構(gòu)建第一個重組DNA分子。1983年，世界上獲得首例轉(zhuǎn)基因植物。1985年，創(chuàng)建葉盤法進行植物的遺傳轉(zhuǎn)化。迄今，已成功獲得大量的轉(zhuǎn)基因植物，園林植物包括矮牽牛、金魚草、菊花、非洲菊、香石竹、滿天星、月季、百合、唐菖蒲、郁金香、仙客來、石蒜、水仙、花葉芋、吊蘭、長春花、南非菊、風(fēng)鈴草、半邊蓮、六出花、夏堇、草原龍膽、蔓陀羅、長壽花、秋海棠、蝴蝶蘭、石斛、結(jié)縷草、高羊茅、山茶、連翹、杜鵑花、楊樹、桉樹、刺槐、美國楓香、歐洲白樺、挪威云杉、松類等。二、 植物基因工程的一般程序與方法.目的基因的分離與克隆PCR技術(shù)轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)基因組相減技術(shù)cDNA差異顯示技術(shù)等.植物表達載體的構(gòu)建）啟動子的選擇組成型啟動子：35S特異性啟動子：組織特異性、誘導(dǎo)特異性）終止子）選擇標(biāo)記基因：npt-II、hpt、bar等.植物的遺傳轉(zhuǎn)化）農(nóng)桿菌介導(dǎo)法2） 基因槍法3） 花粉管通道法）其他方法：PEG法、電激法、顯微注射法、激光法、脂質(zhì)體法、超聲波法、真空浸潤法、碳硅纖維介導(dǎo)法.轉(zhuǎn)化細胞的篩選及轉(zhuǎn)基因植物的鑒定）轉(zhuǎn)化體的篩選抗性篩選：利用選擇標(biāo)記基因利用報告基因：GUS、GFP2）轉(zhuǎn)化體的鑒定PCR檢測Southern雜交Northern雜交Western雜交.轉(zhuǎn)基因植物的安全性評價與商業(yè)釋放二、基因工程在園林植物育種中的應(yīng)用.植物基因工程育種的優(yōu)點從基因水平上修飾植物的遺傳物質(zhì)，定向改造植物的遺傳性狀，提高了育種的目的性和精確性；打破物種之間的生殖隔離障礙，實現(xiàn)了基因資源在生物界的共享，大大地擴展了育種的范圍；在很大程度上縮短了育種周期。.基因工程在園林植物遺傳改良中的應(yīng)用修飾花色改良花型增加花香延緩衰老延長花期改變株形創(chuàng)造不育提高抗病蟲能力改善抗逆性抗除草劑改善生長特性治理環(huán)境污染第四節(jié)分子標(biāo)記及其在育種中的應(yīng)用一、常見DNA分子標(biāo)記技術(shù)基于DNA-DNA雜交的DNA標(biāo)記：RFLP基于PCR技術(shù)的DNA標(biāo)記：RAPD、ISSR；SSR、SCAR基于限制性酶切和PCR的DNA標(biāo)記：AFLP、CAPS基于單個核苷酸多態(tài)性的DNA標(biāo)記：SNP.RFLP標(biāo)記限制性片段長度多態(tài)性（RestrictionFragmentLengthPolymorphism））工作原理：由于單堿基的替換、DNA片斷的插入、缺失、易位、倒位等，引起同源DNA序列上限制性內(nèi)切酶的識別位點或位點間的DNA區(qū)段不同，從而導(dǎo)致酶切片段的多態(tài)性。）基本程序：酶切一電泳后轉(zhuǎn)膜一預(yù)雜交/雜交一放射自顯影。）特點：共顯性標(biāo)記，不受顯隱性、環(huán)境和發(fā)育階段的影響；多態(tài)性豐富，重復(fù)性穩(wěn)定性好。實驗過程中需對探針進行標(biāo)記，操作繁瑣，耗時費力；DNA需求量大。目前已較少使用。.RAPD標(biāo)記隨機擴增多態(tài)性DNA（RandomAmplifiedPolymorphicDNA））工作原理：利用一系列不同的隨機引物（9-10bp）對所研究物種的基因組DNA進行擴增，模板DNA序列上引物的結(jié)合位點不同，導(dǎo)致擴增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性。）基本程序：引物篩選一PCR擴增一瓊脂糖凝膠電泳一譜帶分析。）特點：操作簡單易行，一套引物可用于不同物種的基因組分析；多態(tài)性高，所需DNA量少。顯性標(biāo)記，不能區(qū)分顯性純合和雜合基因型；實驗結(jié)果易受實驗條件的影響，重復(fù)性較差。應(yīng)用較多：品種分類、種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性分析等。.SSR標(biāo)記微衛(wèi)星簡單重復(fù)序列（MicrosatelliteSimpleSequenceRepeats））工作原理：以2-6個核苷酸為基本單元的簡單串聯(lián)重復(fù)序列稱為微衛(wèi)星或簡單序列重復(fù)；SSR座位兩側(cè)具有保守的單拷貝序列，不同物種或品種，所含SSR各異（重復(fù)次數(shù)不同））基本程序：設(shè)計特異引物一PCR擴增一聚丙稀酰胺凝膠電泳一多態(tài)性分析。）特點：操作簡便，穩(wěn)定可靠；具有大量的等位差異，多態(tài)性十分豐富。依賴SSR的克隆和測序設(shè)計引物，開發(fā)成本較高。應(yīng)用前景好：遺傳作圖、種質(zhì)鑒定、品種分類.AFLP標(biāo)記限制性擴增片段長度多態(tài)性（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism））工作原理：通過對基因組DNA酶切片段的選擇性擴增來檢測DNA酶切片段長度的多態(tài)性。PCR與RFLP相結(jié)合的產(chǎn)物。多態(tài)性來自酶切位點和其后的選擇性堿基的變異。）基本程序：總DNA酶切，寡聚核苷酸連接頭的連接一PCR擴增一聚丙稀酰胺凝膠電泳一檢測。）特點