玉米赤霉烯酮的生物脫毒研究進展

玉米赤霉烯酮的生物脫毒研究進展

玉米又名紅二醇，也被稱為f-2毒素。這是刀菌產(chǎn)生的次代謝產(chǎn)物，stob等。目前，玉米赤霉烯酮的脫毒技術(shù)已引起了人們的高度重視，主要是利用物理、化學(xué)和生物脫毒法在本研究前期，發(fā)現(xiàn)鹽堿土壤中存在著豐富的酚類化合物降解菌1材料和方法1.1實驗菌株菌株WLB-29分離自鹽角草根際土壤1.2細胞、培養(yǎng)基和儀器玉米赤霉烯酮(標(biāo)準品)，上海源葉生物科技有限公司；甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)，賽默飛世爾(Fisher)科技中國有限公司；Genview細菌基因組DNA提取試劑盒，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；LB培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基、R2A培養(yǎng)基和NB培養(yǎng)基，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；M培養(yǎng)基(海生菌肉湯2216)，上海創(chuàng)賽科技有限公司。超聲波細胞破碎儀，Branson公司；高效液相色譜儀(HPLC),Agilent公司。無機鹽培養(yǎng)基(g/L):Na1.3單一碳源利用及耐鹽特性分析分別接種菌株至含有10mg/LZEN的無機鹽培養(yǎng)基平板和LB培養(yǎng)基斜面上，30°C恒溫培養(yǎng)3d，置于4°C保存，備用。菌體鏡檢染色采用結(jié)晶紫染色法。菌株單一碳源利用分析采用BiologGenII鑒定板，挑取少量新鮮培養(yǎng)的菌體制備菌懸液，接種到BiologGenII鑒定板，于28°C恒溫培養(yǎng)48h，利用Biolog自動微生物鑒定系統(tǒng)讀取數(shù)據(jù)，分析其單一碳源利用情況。菌株的生長溫度耐受(10、45°C)測定采用LB培養(yǎng)基平板進行；菌株耐鹽特性的測定采用含有不同濃度NaCl(2%、5%、10%)的LB培養(yǎng)基平板進行；菌株耐ZEN特性的測定采用含有不同濃度ZEN(10、20、40、60mg/L)的無機鹽培養(yǎng)基平板進行。1.4pcr擴增實驗挑取少量新鮮菌體作為PCR擴增模板，采用細菌16SrRNA基因序列PCR通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-AAGGAGGTGATCCAGCCCGCA-3′)，擴增實驗菌株目的片段。PCR反應(yīng)體系(50μL):2×Mix25μL，正、反向引物(10μmol/L)各1μL,ddH所得序列經(jīng)人工校對后，分別上傳至EzTaxon數(shù)據(jù)庫和GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，調(diào)取相近的模式菌株序列。序列相似性分析和NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(BootstrapValue=1000)構(gòu)建采用MEGA7.0軟件，以初步明確實驗菌株WLB-29的分類地位1.5樣品溶液的配制采用Agilent1260高效液相色譜儀對ZEN含量進行測定，色譜柱為安捷倫ZORBAXEclipseXDB-C18柱(4.6mm×150mm，粒徑5mm)；流動相為乙腈:水:甲醇=46:46:8(體積比)；流速為0.8mL/min；進樣量為10μL；柱溫為30°C；檢測波長為254nm。分別配制濃度為0.5、1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、20.0mg/L的ZEN標(biāo)準溶液。在上述色譜條件下，依次從低濃度到高濃度進樣，記錄各樣品ZEN峰面積A(mAU·S)，并與對應(yīng)標(biāo)準溶液濃度c(mg/L)繪制ZEN標(biāo)準曲線。1.6有機濾膜的制備取1mL發(fā)酵液，加入等體積的甲醇充分混勻，使用超聲波處理10min(功率20kHz，工作時間3s，間歇時間3s)，然后8000r/min離心5min，吸取上清液，并利用有機濾膜(0.22μm)過濾，所得溶液上機檢測1.7菌株降解zen的影響因素實驗初始條件為取菌種活化后的種子液1mL，接種到100mL的LB液體培養(yǎng)基中，30°C、120r/min振蕩培養(yǎng)120h后，取樣檢測菌液OD在此基礎(chǔ)上，通過單因素優(yōu)化，考察不同培養(yǎng)基(LB、NB、MA、R2A、TSB)、不同溫度(20、25、30、37、42°C)、不同初始pH值(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)、不同菌液接種量(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)和不同ZEN濃度(2、4、6、8、10mg/L)對菌株降解ZEN能力的影響，每個條件設(shè)置3個重復(fù)，并進行條件優(yōu)化1.8蘑菇價格降低在各條件因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上進行菌種發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)試驗設(shè)置3個重復(fù)，每24h取一次培養(yǎng)液，測定OD2結(jié)果與分析2.1菌株的生長和nj系統(tǒng)發(fā)育樹菌株WLB-29分離自烏拉泊鹽湖周邊植物鹽角草根際土壤，相關(guān)樣品接入以10mg/LZEN為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基，于30°C、120r/min條件下振蕩富集培養(yǎng)4d后，富集液經(jīng)梯度稀釋、涂布，待菌落長出后，根據(jù)菌落在ZEN為唯一碳源培養(yǎng)基中的生長速度、形態(tài)、大小及顏色初篩，再通過檢測降解效率進行復(fù)篩而獲得試驗菌株通過培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，菌株WLB-29為革蘭氏陰性、球狀細菌，可在LB、TSB等營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上良好生長，也可以在R2A、MA及以ZEN為單一碳源的無機鹽培養(yǎng)基等貧營養(yǎng)培養(yǎng)基上良好生長。通過Biolog碳源實驗表明，菌株可以利用的碳源物質(zhì)主要有D-果糖、檸檬酸、D-甘露醇、α-酮戊二酸和L-谷氨酸等。在以ZEN為單一碳源的無機鹽培養(yǎng)基上，菌株可在10-40mg/LZEN條件下良好生長，可耐10%的NaCl，生長溫度范圍在10-45°C。采用LB培養(yǎng)基于30°C培養(yǎng)2d，其菌落形態(tài)呈圓形，較小(直徑約為1mm)，乳白色，表面濕潤、有光澤，半透明，邊緣比較平整(圖1)。通過對菌株WLB-29的16SrRNA基因序列進行擴增和測序，上傳其16SrRNA基因序列至GenBank(登錄號為MT196321)，并構(gòu)建了其NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。結(jié)果表明，菌株WLB-29歸屬于斯塔普氏屬(Stappia)，與其相似性最高的模式菌株為印度洋斯塔普氏菌(StappiaindicaB1062.2色譜結(jié)果分析HPLC檢測ZEN標(biāo)準品的色譜圖如圖3所示，在實驗采用的色譜條件下，ZEN標(biāo)準品的保留時間為8.726min，色譜波峰完整，對稱性良好，分辨率較好。不同濃度的ZEN出峰時間穩(wěn)定，即使在最低濃度0.5mg/L時，波峰仍較為完整，可有效檢出。根據(jù)峰面積和ZEN濃度關(guān)系繪制其標(biāo)準曲線(圖4)，計算得到回歸方程為Y=19.010X-3.115,R2.3培養(yǎng)條件對蘑菇分解的影響2.3.1b-29的生長和降解率使用不同培養(yǎng)基分析培養(yǎng)基對菌株WLB-29的生長和降解率的影響，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，菌株在LB液體培養(yǎng)基上生長最好，最大生長OD2.3.2接種量對菌株降解zen的影響在發(fā)酵過程中，采用較大的接種量可以縮短發(fā)酵時間，使產(chǎn)物的形成提前到來，實驗分析了接種量對菌株WLB-29生長和ZEN降解率的影響。由圖6可見，在實驗中菌液OD2.3.3en降解情況實驗使用菌株生長較為明顯的多個溫度，對菌株WLB-29生長和ZEN降解情況進行了分析。由圖7可知，菌株在實驗所用的溫度范圍中均能較好地生長，最適生長溫度范圍在30-42°C。在ZEN降解情況方面，在20-37°C內(nèi)，菌株對ZEN降解率隨著菌株生長OD2.3.4培養(yǎng)階段的ph值對植物分解的影響培養(yǎng)基初始pH值對菌株WLB-29生長和ZEN的降解率的影響見圖8。在實驗中菌株的OD2.3.5培養(yǎng)培養(yǎng)基中zen濃度如圖9所示，菌株WLB-29的生長和ZEN的降解率受ZEN濃度的直接影響，其中，當(dāng)培養(yǎng)基中ZEN濃度增大時，發(fā)酵液中微生物細胞濃度呈下降趨勢，這可能與ZEN對菌株WLB-29細胞有毒副作用有關(guān)。同時，ZEN的降解率受培養(yǎng)基中ZEN濃度加大的影響非常明顯，當(dāng)培養(yǎng)基中ZEN濃度低于6mg/L時菌株降解效率較低；當(dāng)大于8mg/L時其降解效率明顯提高，但繼續(xù)增加培養(yǎng)基中ZEN濃度時降解率增加不明顯。2.4菌株對zen的降解規(guī)律采用優(yōu)化后條件，即：使用ZEN終濃度為10mg/L的LB液體培養(yǎng)基，菌液接種量為2%，初始pH為8.0，發(fā)酵溫度37°C，定期檢測菌液濃度和培養(yǎng)基中ZEN的含量，并計算其降解率，繪制菌株的生長曲線和ZEN降解曲線。如圖10所示，菌株接種8h后進入對數(shù)期，發(fā)酵48h后逐漸進入穩(wěn)定期；菌株WLB-29對ZEN的降解伴隨著整個菌株的生長過程，而且與發(fā)酵時間呈線性關(guān)系，降解過程在菌株進入穩(wěn)定期后仍可對ZEN進行有效降解，培養(yǎng)至144h時降解率最高可達到92.56%。同時，分別對實驗中菌株生長12h和144h的發(fā)酵液進行HPLC檢測，色譜圖見圖11。由圖11可見，與菌株生長12h后的發(fā)酵液相比，144h的發(fā)酵液中ZEN幾乎完全降解，但其在HPLC檢測1.0、3.0、4.0、7.3、7.7min中相關(guān)產(chǎn)物峰值明顯增加。由于本次HPLC采用的紫外光檢測器(波長：254nm)其著色基團主要為苯環(huán)，因此初步可以推斷，菌株對ZEN降解主要發(fā)生在其內(nèi)酯環(huán)，并形成了多種苯類化合物，但相關(guān)化合物具體結(jié)構(gòu)有待進一步驗證。3玉米赤霉烯酮菌株的降解菌株耐鹽菌可降解多種難降解有機化合物，特別是在化工有機污水處理中有著明顯的優(yōu)勢，國內(nèi)外也在各類鹽環(huán)境中分離出大量多酚類化合物降解菌通過對該菌株降解ZEN條件優(yōu)化，在培養(yǎng)基中加入ZEN，該菌降解最佳條件為：LB培養(yǎng)基、37°C培養(yǎng)、pH8.0、2%接種量和ZEN初始濃度為10mg/L，培養(yǎng)144h后，ZEN的降解率最高可