病毒的分離鑒定

病毒的分別與鑒定要證明某種疾病是由某一感染性病毒所引起，則必需滿(mǎn)足以下原則：①?gòu)幕疾≌唧w內(nèi)分別出病毒；②在試驗(yàn)動(dòng)物或寄主細(xì)胞中可以培育；③證明這種培育物具有濾過(guò)性；④在原始宿主或相關(guān)種屬內(nèi)能產(chǎn)生同樣的病癥；⑤能重分別出病毒。病毒的分別標(biāo)本的處理標(biāo)本的收集5g50mlPBS20-25顆玻璃小100ml無(wú)菌瓶中，攪拌成懸液，倒出上清，3000Xg,4C心6min。拭子和生物體液：拭子浸在2-3ml運(yùn)載培育基中，將棉拭子中的3000Xg4C30min。組織標(biāo)本：用無(wú)菌乳缽或勻漿器研磨組織標(biāo)本，同時(shí)參加足量的PBS20%的懸液，3000Xg4C30min。除菌處理a〕10000單位/4Cb〕鼻咽拭子一般加抗生素最終濃度為2023單位/4C4小時(shí)。精選文庫(kù)精選文庫(kù)C〕對(duì)乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、腸道病毒、呼腸孤病毒、腺病毒、痘病毒等，則可參加等量的乙醚4C病毒的分別培育病毒是嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生微生物，培育病毒必需使用細(xì)胞。依據(jù)病毒的不同選用敏感動(dòng)物〔動(dòng)物接種〕、雞胚〔雞胚接種〕或離體細(xì)胞進(jìn)展分別培育〔細(xì)胞培育〕。雞胚接種 雞卵的選擇：一般都選穎、10天以?xún)?nèi)的受精卵以保證規(guī)格質(zhì)量上的全都。孵育：孵育時(shí)可將雞卵放入卵箱內(nèi)進(jìn)展，氣室向上，孵育的最適溫38--39C40—708日后，雞卵應(yīng)每天1—2次，以幫助雞胚發(fā)育均勻和防止雞胚膜粘連。C 4?5天后，即可用檢卵器檢查雞胚發(fā)育狀況〔二〕天一次〕。①未受精雞卵：在檢卵器上僅見(jiàn)到模糊的陰影。②活雞4天后，在檢卵器上就可見(jiàn)到清楚的血管，雞卵內(nèi)有一小黑點(diǎn)〔雞胚〕，有明顯的自然轉(zhuǎn)動(dòng)。③死胎：假設(shè)覺(jué)察雞卵血管模糊、擴(kuò)張、胚胎活動(dòng)呆滯或不能自主地轉(zhuǎn)動(dòng)，則可推斷胚胎頻死或已經(jīng)死亡，應(yīng)將其挑撿出來(lái) 雞胚孵育完畢后，用鉛筆劃出氣室邊緣和胚胎的位置待用。

1.雞胚卵黃囊接種：用5?8天雞胚，以瘦長(zhǎng)12?囊膜檢查胚,常用于某些羊膜腔病毒育分取羊水檢查。常用干流感病毒的初次分別。精選文庫(kù)精選文庫(kù)3圖3.圖3.尿囊腔接種9?12天雞弗賈0胚，將標(biāo)本接種于尿囊腔，腮腺炎病毒等。4.10?l2天amme)剖檢及收獲14C過(guò)夜，使雞胚內(nèi)血液凝固。收獲時(shí)，用碘酒將氣室部卵殼消毒,將氣室處卵殼剝?nèi)ァ膊灰獙⑺槠淙霘つぁ?。然后用無(wú)菌手術(shù)刀柄從胚胎背部輕輕下壓，〔切勿壓破卵黃囊〕再用吸管吸取尿囊液，置青霉素小瓶?jī)?nèi)，于低溫保存。f〕優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：技術(shù)簡(jiǎn)潔、來(lái)源充分、價(jià)格低廉、數(shù)量可大、不需特別設(shè)備。缺點(diǎn)：很多病毒不能適應(yīng)，主要是哺乳動(dòng)物的病毒。122細(xì)胞培育細(xì)胞培育〔cellculture〕是指利用機(jī)械、酶或化學(xué)方法使動(dòng)物組織或2?4個(gè)細(xì)胞團(tuán)懸液進(jìn)展培育。依據(jù)細(xì)胞的精選文庫(kù)精選文庫(kù)4類(lèi)型和培育細(xì)胞代數(shù)的不同，可將其分為兩種：原代細(xì)胞培育；傳代細(xì)胞培育。組織細(xì)胞培育的病毒，當(dāng)消滅穩(wěn)定的細(xì)胞病變后，就可取培育液或培育液與細(xì)胞培育物混和物，細(xì)胞培育物中的病毒可承受凍融、超聲波等方法使其釋放出來(lái)。優(yōu)點(diǎn):每個(gè)細(xì)胞生理特性根本全都，對(duì)病毒易感性相等;無(wú)個(gè)體差異，準(zhǔn)確性和重復(fù)性好;C)可嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌操作;細(xì)胞培育本身就能顯示病毒的生長(zhǎng)特征;應(yīng)用空斑技術(shù)可進(jìn)展病毒的克隆化。病毒的鑒定形態(tài)學(xué)鑒定細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathiceffect，CPE)：病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖后,可引起細(xì)胞的不同變化。常見(jiàn)的形態(tài)學(xué)轉(zhuǎn)變?nèi)缂?xì)胞圓縮、聚合、溶解或脫落。CPE消滅的時(shí)間是鑒定病毒的標(biāo)志之一。某些病毒感染細(xì)胞產(chǎn)生的特征性的形態(tài)變化，在一般光學(xué)顯微鏡F可見(jiàn)胞漿或胞核內(nèi)消滅的呈嗜酸性或嗜堿性染色、形或不規(guī)章形的團(tuán)塊狀構(gòu)造，病毒學(xué)上稱(chēng)為包涵體。血吸附和血凝作用

大小數(shù)量不等的圓多見(jiàn)于以出芽方式釋放的病毒。血吸附指感染細(xì)胞具有吸附紅細(xì)胞的力量；血凝作用指感染細(xì)胞的培育液中有很多游離病毒存在，具有凝集紅細(xì)胞的作用。221血吸附試驗(yàn)具有血凝力量的病毒能使感染的細(xì)胞吸附紅細(xì)胞， 這種現(xiàn)象被稱(chēng)作吸附作用。大多數(shù)粘液病毒能引起吸附。具體檢驗(yàn)步驟如下:PBS10%的豚鼠紅細(xì)胞懸液，4C0.5%的濃度〔10%1ml19mlPBS混勻〕。吸去比照和試驗(yàn)管培育細(xì)胞的上清液，試驗(yàn)管的上清液留待電鏡觀察。C 0.2ml紅細(xì)胞懸液，4C30min4CPBS清洗〕3次。顯微鏡下讀取結(jié)果并記錄，依據(jù)吸附紅細(xì)胞的量可分為0〔陰性〕~4〔完全吸附〕級(jí)。37C60min,有神經(jīng)氨酸酶的病毒將會(huì)從紅細(xì)胞上游離下來(lái)。2.2.2血凝試驗(yàn)1~1250al生理鹽水。150al50al2L,如此倍比1050al;最終兩孔〔11、12〕為紅細(xì)胞比照。C)1%1~1250al。d)手工震蕩，37C30min〔40min〕后觀看結(jié)果。電子顯微鏡檢查病毒的很多特征如大小、形態(tài)、構(gòu)造等必需借助電子顯微鏡進(jìn)展檢查。對(duì)于目前尚難培育而形態(tài)又格外典型的病毒， 可直接從感染組織或分泌液，或者接種病料的雞胚和細(xì)胞培育收獲的材料作電子顯微鏡檢查，直接觀看病毒粒子。7〔戊二醛/四氧化鋨〕77透、包埋與聚合77〔鈾染/鉛染〕a〕優(yōu)點(diǎn)：可觀看病毒形態(tài)和形態(tài)發(fā)生過(guò)程。b〕缺點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，費(fèi)時(shí)，但標(biāo)本可長(zhǎng)時(shí)間保存。負(fù)染技術(shù)負(fù)染是指通過(guò)重金屬鹽在樣品四周的積存而加強(qiáng)樣品外周的電子密度，使樣品顯示負(fù)的反差，襯托出樣品的形態(tài)和大小。具體步驟〔漂移法〕為：現(xiàn)將需負(fù)染的樣品滴幾滴在干凈的載玻片上，再將有支持膜的載網(wǎng)漂移在樣品液滴上以沾取樣品，用濾紙吸干樣品余液使樣品在載網(wǎng)上僅有一薄層液膜，在樣品未干時(shí)即加一滴復(fù)染液的銅網(wǎng)上，用濾紙吸干多余的染液即可。a〕優(yōu)點(diǎn)：快速簡(jiǎn)易〔10-20min〕;區(qū)分率高；圖象清楚地病毒構(gòu)造。b〕107以上；全部樣品應(yīng)處于懸浮狀態(tài)。血清學(xué)試驗(yàn)ELISA、瓊脂集中、中和試驗(yàn)、標(biāo)記抗體技術(shù)等免疫血清學(xué)方法檢查病畜的抗體消長(zhǎng)狀況和發(fā)病組織中的病毒抗原。241中和反響利用病毒與特異性中和抗體結(jié)合的特性鑒定病毒的種類(lèi)， 觀看特異性抗體能否保護(hù)易感的試驗(yàn)動(dòng)物死亡，能否抑制病毒的細(xì)胞病變效應(yīng)。2.4.2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 〔ELISA〕將