初研克隆在癌癥治療中的運用

精品文檔-下載后可編輯初研克隆在癌癥治療中的運用1腫瘤細胞中c-FLIP的過表達

在一系列癌癥，如結(jié)腸癌、胃癌、胰腺癌、黑色素瘤、卵巢癌、前列腺癌中表達較高。在大多數(shù)情況下，c-FLIPL在惡性腫瘤中表達增加;另有研究表明c-FLIPS表達也上調(diào)，如在胃癌SNU-216細胞和胰腺癌中c-FLIPS表達上調(diào)。c-FLIP的過表達可增加拮抗Fas、TRAIL介導(dǎo)的細胞凋亡。研究證實，在某些組織中c-FLIP的高表達水平還與腫瘤的遷徙有關(guān)。在結(jié)腸癌、宮頸癌、伯基特淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和膀胱癌中，c-FLIP的表達水平升高與不良預(yù)后有關(guān)。c-FLIP異構(gòu)體在腫瘤細胞中過表達，其表達水平不僅與死亡受體靶向的治療有關(guān)，還與傳統(tǒng)治療有關(guān)，因為c-FLIP抑制抗癌藥物誘導(dǎo)的細胞凋亡。

2c-FLIP的作用

在外部凋亡通路中，c-FLIP募集到DISC中可以抑制Caspase-8前體的二聚化和活性，從而抑制凋亡事件的發(fā)生。c-FLIPL與Caspase-8前體可以形成一個異源二聚體，c-FLIPL與Caspase-8前體的異源二聚化，可以誘導(dǎo)Caspase-8的活性。復(fù)合體中Caspase-8的有限激活可以產(chǎn)生p43-c-FLIP和p41/p43-Caspase-8亞單元，然而由于c-FLIPL缺乏蛋白酶水解活性，進一步的切割不能發(fā)生，切割的產(chǎn)物繼續(xù)與DISC結(jié)合，阻止凋亡信號的進一步轉(zhuǎn)導(dǎo)。盡管如此，活化的Caspase-8能夠接近部分底物，如RIP。RIP在細胞膜上不同的切割，可以導(dǎo)致由Fas配體激活c-FLIPL和c-FLIPS對下游信號通路中c-Fos或者NF-κB的不同調(diào)節(jié)。

3c-FLIP的轉(zhuǎn)錄表達調(diào)節(jié)

越來越多的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子被發(fā)現(xiàn)結(jié)合在c-FLIP的啟動子上，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子對c-FLIP異構(gòu)體的不同調(diào)節(jié)，可能是以一種細胞依賴的方式，在特定刺激條件下決定細胞的命運。實驗證明，調(diào)控c-FLIP的轉(zhuǎn)錄因子有NF-κB、p53、p63、FOXO3a、EGR1、AR、Sp1、E2F1、c-Myc、IRF5、c-Fos、NFATc2和hnRNPk。NF-κB、p53、p63、NFAT、EGR1、hnRNPK、AR和Sp1誘導(dǎo)c-FLIP的表達;而c-Myc、FOXO3a、c-Fos、IRF5和Sp3抑制c-FLIP的轉(zhuǎn)錄。許多信號通路通過激活這些轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)控c-FLIP，其中涉及到TNF配體、生長因子、白介素、趨化因子、DNA損傷試劑或者非傳統(tǒng)的化療試劑。TNF-α和CD40配體可激活NF-κB，導(dǎo)致c-FLIP表達上調(diào)從而抑制Fas、TNFR1和TRAIL受體介導(dǎo)的細胞凋亡［。另外PI3K、Akt、MAPK信號通路的激活或者生長因子刺激，也可以誘導(dǎo)c-FLIP的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)。趨化因子IL-8在前列腺癌細胞系中，通過激活NF-κB和雄性激素依賴的轉(zhuǎn)錄方式而增加c-FLIPS和c-FLIPL的mRNA水平。干擾素-β介導(dǎo)的的激活與PMA或者TRAIL誘導(dǎo)的c-Fos的激活可抑制c-FLIP的表達。c-FLIP異構(gòu)體的調(diào)節(jié)機制現(xiàn)在還不完全清楚，可能依賴于轉(zhuǎn)錄因子或者激活的信號通路，還可能依賴于特定的細胞系。在肺癌中，E2F1可抑制c-FLIPS而不是c-FLIPL的表達;在活性T-細胞中c-FLIPS的表達上調(diào)特別依賴于NFATc2;CD40介導(dǎo)的c-FLIPR的表達上調(diào)可抑制Fas誘導(dǎo)的細胞凋亡。盡管c-FLIPL和c-FLIPS都受NF-κB調(diào)節(jié)，但在紅白血病細胞系TF-1中，c-FLIPR的表達是以不依賴于NF-κB的方式被TNF激活所誘導(dǎo)。在HaCat細胞系中用RNAi篩選p63靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)，同一種轉(zhuǎn)錄因子對不同c-FLIP異構(gòu)體的調(diào)節(jié)可能不同。p63可能專門誘導(dǎo)c-FLIPR的表達，而抑制c-FLIPR并不影響c-FLIPL表達水平。因此，有必要在不同細胞中研究c-FLIP異構(gòu)體的表達調(diào)控機制。

3.1PKCε/NF-κB信號通路

對c-FLIP的調(diào)節(jié)NF-κB是真核細胞的轉(zhuǎn)錄因子，幾乎存在于所有的細胞中。在有害刺激(如病毒、脂多糖、佛波酯及dsRNA)等作用下，PKCε活化并激活NF-κB轉(zhuǎn)位到細胞核，與多種細胞因子、應(yīng)激相關(guān)等基因啟動子和增強子上的κB序列特異結(jié)合，促進細胞因子的過表達和細胞在應(yīng)激條件下的存活和生長。研究發(fā)現(xiàn)，PKCε的活化可以增強c-FLIPmRNA的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)c-FLIP表達上調(diào);而NF-κB活性的抑制則能抑制PKCε誘導(dǎo)的c-FLIP的表達上調(diào)。人T細胞白血?、裥筒《景┑鞍譼ax可以通過激活NF-κB誘導(dǎo)c-FLIP的表達，抑制Fas介導(dǎo)的細胞凋。NF-κB抑制劑DHMEQ可抑制CLL細胞內(nèi)NF-κB的活性誘導(dǎo)細胞凋亡，并伴隨NF-κB依賴的抗凋亡基因，如c-IAP、Bfl-1、Bcl-xL和c-FLIP等基因的表達下調(diào)。由此可見在上調(diào)c-FLIP表達的過程中，PKCε/NF-κB信號通路以及NF-κB的活性起了至關(guān)重要的作用。

3.2PI3K/Akt信號通路

對c-FLIP的調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路與細胞生長、增殖及癌變密切相關(guān)，是細胞內(nèi)一條重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。PI3K催化磷脂酰肌醇(PI)磷酸化生成PIP3，在PIP3存在的情況下，磷脂酰肌醇依賴性激酶，PDK-1)能磷酸化Akt/PKB并使之活化。在腫瘤細胞內(nèi)，PI3K通過Akt的磷酸化可增強c-FLIPmRNA的轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)表達水平。PI3K抑制劑下調(diào)c-FLIP的表達，增強Fas介導(dǎo)的HL-60細胞凋亡的敏感性。盡管在口腔磷狀上皮細胞癌(OSCC)中，PI3K抑制劑Waltman和LY294002不影響OSCC細胞中Fas的表達，卻能強烈抑制Akt的磷酸化、顯著降低細胞內(nèi)c-FLIP的水平，促進Fas介導(dǎo)的細胞凋亡。c-Myc作為一個癌基因，在細胞增殖和細胞凋亡中具有雙重作用。PI3K/Akt信號通路的激活可誘導(dǎo)c-Myc的轉(zhuǎn)錄，而c-Myc表達增加可使c-FLIP表達降低，促進TRAIL誘導(dǎo)的細胞凋亡。染色質(zhì)免疫沉淀及熒光標(biāo)記分析顯示，c-Myc結(jié)合并抑制了c-FLIP的啟動子，c-Myc的表達增強了TRAIL誘導(dǎo)的DISC中Caspase-8的活性，從而促進了c-FLIP的降解。在對TRAIL敏感的細胞系中，c-Myc的表達水平與細胞對TRAIL的敏感性呈正相關(guān)。過表達c-Myc或激活融合的Myc-ER(雌激素受體)，可增加TRAIL耐受細胞對TRAIL敏感性;如果用siRNA抑制c-Myc活性，能顯著降低c-Myc的表達和TRAIL誘導(dǎo)的細胞凋亡。c-FLIP是c-Myc的直接靶向作用蛋白，無論是在培養(yǎng)細胞還是在c-Myc誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生的小鼠動物模型中，過表達c-Myc或者活化Myc-ER都能降低c-FLIP的表達水平，而用siRNA抑制c-Myc的活性則能增強c-FLIP的表達。另外，補體C5b-9復(fù)合物可以抑制凋亡蛋白Caspase-8的活化以及對Bid的切割，顯著提高c-FLIPL蛋白的表達水平。但是，PI3K抑制劑LY294002可逆轉(zhuǎn)C5b-9復(fù)合物的抗凋亡效應(yīng)。綜上所述，PI3K/Akt信號通路對c-FLIP的表達調(diào)控具有很重要的作用。

3.3轉(zhuǎn)錄因子

E2F1對c-FLIP的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子E2F1是在細胞周期S期及細胞凋亡過程中起作用的轉(zhuǎn)錄因子。研究發(fā)現(xiàn)，低水平表達E2F1的肺癌細胞中，c-FLIPs特異性過表達;在不同的肺癌細胞系中，E2F1可以通過下調(diào)c-FLIPS并激活死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體DISC中Caspase-8，誘導(dǎo)細胞凋亡。E2F1可促進Fas和TRAIL介導(dǎo)的腫瘤細胞凋亡，增強T淋巴細胞抗腫瘤的細胞毒效應(yīng)。在原發(fā)性肺癌細胞中低水平的E2F1可能是促成細胞癌變的一個重要因素，其表達水平的下調(diào)將促成腫瘤細胞的免疫逃逸。因此，在死亡受體介導(dǎo)的細胞凋亡通路中，E2F1是一個至關(guān)重要的細胞凋亡轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。

3.4其他干細胞因子

(SCF)可增強c-FLIPmRNA的轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)表達，減弱IFN-γ誘導(dǎo)的細胞凋亡。研究認為，雄激素可以提供前列腺上皮細胞生存信號，前列腺中雄激素的去除會誘導(dǎo)細胞凋亡。在雄激素存在的情況下，雄激素受體被募集到c-FLIP基因的啟動子上，誘導(dǎo)c-FLIP基因的表達，研究表明在雄激素作用下，雄激素受體可以通過調(diào)節(jié)c-FLIP基因影響前列腺細胞的存活和凋亡。TRAIL誘