【課件】微生物的選擇培養(yǎng)與計數(shù)課件高二下學期生物人教版選擇性必修3

1.2.2微生物的選擇培養(yǎng)和計數(shù)1973年，科學家從美國黃石國家公園的熱泉中篩選出水生棲熱菌(Thermusaquaticus)，進而從這種菌中提取出耐高溫的DNA聚合酶。這種酶目前已被廣泛用于體外擴增DNA片段的聚合酶鏈式反應(PCR)。1.為什么水生棲熱菌能更容易在熱泉中找到并被篩選出來呢？這是因為水生棲熱菌適應熱泉的環(huán)境，能在70~80℃的高溫條件下生存，而絕大多數(shù)微生物在此條件下不能生存。2.在自然界中，想進行微生物篩選的原則是什么？耐熱微生物耐寒微生物石油分解菌根據(jù)微生物對生存環(huán)境的要求，到相應環(huán)境中去尋找。實驗室中微生物的篩選，也可以應用同樣的原理，即人為提供有利于目的菌生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度和pH等)，同時抑制或阻止其他微生物的生長。選擇培養(yǎng)基：在微生物學中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基，稱為選擇培養(yǎng)基。不加碳源的培養(yǎng)基分離出自養(yǎng)微生物分離耐熱菌70～80℃的高溫不加氮源的培養(yǎng)基分離固氮微生物加青霉素的培養(yǎng)基分離真菌一、選擇培養(yǎng)基加高濃度食鹽分離金黃色葡萄球菌

改變培養(yǎng)條件

添加某種化學物質(zhì)

營養(yǎng)缺陷尿素[CO(NH2)2]尿素[CO(NH2)2]含氮量高，化學性質(zhì)相對穩(wěn)定，是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中一種重要的氮肥，尿素不能直接被農(nóng)作物吸收，尿素施入土壤中，需要土壤中的細菌將尿素分解成NH3，NH3再轉化為NO3-、NH4+等被植物利用。思考·討論

選擇培養(yǎng)基配方的設計

CO(NH2)2+H2O2NH3+CO2

脲酶一、選擇培養(yǎng)基而這些細菌之所以能分解尿素是因為它們能合成脲酶。脲酶催化尿素分解產(chǎn)生NH3，NH3可作為細菌生長的氮源尿素[CO(NH2)2]1.如果讓你配制一種培養(yǎng)基，將土壤稀釋液中能分解尿素的細菌分離出來，培養(yǎng)基的配方該如何設計？尿素作為唯一氮源這種培養(yǎng)基與普通培養(yǎng)基相比，只是用尿素作為唯一氮源，其他營養(yǎng)成分基本相同。思考·討論

選擇培養(yǎng)基配方的設計

一、選擇培養(yǎng)基1g土壤中有多少能分解尿素的細菌?2.該培養(yǎng)基與普通培養(yǎng)基有哪些共同點和不同點？二、微生物選擇培養(yǎng)通過對土樣進行充分稀釋，再將菌液涂布到制備好的培養(yǎng)基上，即可得到能分解尿素的細菌的純培養(yǎng)物（單菌落）。稀釋涂布平板法兩個基本操作：梯度稀釋和涂布平板稀釋涂布平板法的具體操作步驟?稀釋涂布平板法①鏟取土樣，將樣品裝入紙袋中。90mL無菌水9mL無菌水②將10g土樣加入盛有90mL無菌水的錐形瓶中，充分搖勻，制成菌液。取1mL上清液加入盛有9mL無菌水的試管中，依次等比稀釋。

注意：取土樣時用的鐵鏟和取樣袋在使用前都需要滅菌。操作完成后，一定要洗手。稀釋10倍梯度稀釋③取0.1mL菌液，滴加到培養(yǎng)基表面。④將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。⑤將涂布器放在火焰上灼燒，待酒精燃盡，涂布器冷卻后，再進行涂布。⑥用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時可轉動培養(yǎng)皿，使涂布均勻。涂布平板瀝干移液槍稀釋涂布平板法培養(yǎng)與觀察：待涂布的菌液被培養(yǎng)基吸收后，將平板倒置，放入30～37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2d。稀釋涂布平板法除可以用于分離微生物外，稀釋涂布平板法稀釋涂布平板操作后分離得到單菌落也常用來統(tǒng)計樣品中活菌的數(shù)目。三、微生物的數(shù)量測定——稀釋涂布平板法保證合理稀釋度統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目少每克樣品中的活菌數(shù)≈808278（80/0.1）×105實際土樣中活菌數(shù)目要

8×107

大于當樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個單菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。2.同一稀釋度至少對3個平板進行重復計數(shù)，求平均值（要分析3個重復值得差值大?。┍M量減少誤差每克樣品中的活菌數(shù)≈(C÷V)×MC：平板上平均菌落數(shù)；V：涂布所用體積(mL)；M：稀釋倍數(shù)。1.選擇30-300個菌落的平板進行計數(shù)。3.涂布要均勻三、微生物的數(shù)量測定——顯微鏡直接計數(shù)是一種常用的、快速直觀的測定微生物數(shù)量的方法。利用特定的細菌計數(shù)板或血細胞計數(shù)板，在顯微鏡下觀察、計數(shù)，然后再計算一定體積的樣品中微生物的數(shù)量，統(tǒng)計的結果一般是活菌數(shù)和死菌數(shù)的總和。也可選擇用臺盼藍染色法來區(qū)分活菌和死菌。還有其他的微生物計數(shù)法嗎？三、微生物的數(shù)量測定——其他方法當空氣或者水樣較為純凈，微生物濃度較低時，如何計數(shù)？濾膜法比濁法在一定范圍內(nèi)，菌液的渾濁度與菌的數(shù)量成正比（不分死活菌）（活菌）分光光度計探究實踐：土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)絕大多數(shù)微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作唯一氮源的選擇培養(yǎng)基，可以從土壤中分離出分解尿素的細菌?；A知識：選擇培養(yǎng)基配方：在該培養(yǎng)基上的菌落一定是能分解尿素的細菌嗎？不一定，比如固氮菌；還有些微生物可以利用目的菌的代謝產(chǎn)物來生長繁殖。因此還需要進一步的鑒別。鑒別培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學藥品(不影響微生物正常生長)，使微生物的某種代謝產(chǎn)物與之發(fā)生(不)反應而達到鑒定的作用。P20：在含有纖維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅就是一種鑒別培養(yǎng)基（出現(xiàn)透明圈）。

細菌合成的脲酶將尿素分解為NH3

，NH3會使培養(yǎng)基的堿性增強，pH升高，因此可以通過檢測培養(yǎng)基pH的變化來判斷是否發(fā)生了該化學反應，進而判斷該菌是否為尿素分解細菌。CO(NH2)2+H2O2NH3+CO2

脲酶NH3

(堿性)，使酚紅指示劑呈

色。紅

在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基（選擇培養(yǎng)基）中加入酚紅指示劑（鑒別培養(yǎng)基），培養(yǎng)某種細菌后，如果指示劑變紅，說明該細菌就是能夠分解尿素的細菌。探究實踐：土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)土壤中含有能分解尿素的細菌，我們?nèi)绾畏蛛x它們？每克土壤樣品究竟含有多少這樣的細菌？提出問題作出假設實施實驗設計實驗分析結果表達與交流利用以尿素作為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基并加入酚紅指示劑，進行可以分離和計數(shù)。1.土壤取樣2.制備培養(yǎng)基3.樣品稀釋與取樣涂布4.微生物的培養(yǎng)與觀察探究實踐：土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)（1）土壤取樣①取樣地點要求：酸堿度接近中性的潮濕土壤。②取樣過程：鏟去表層土（一般3cm左右）。①細菌：一般用104、105、106稀釋液。③真菌：一般用102、103、104稀釋液。（3）樣品稀釋與取樣涂布以保證獲得菌落數(shù)在30～300之間適于計數(shù)的平板。

選擇一個比較寬的范圍，將1×103～1×107倍稀釋的稀釋液分別涂布到平板上培養(yǎng)，以保證能從中選擇出菌落數(shù)在30～300的平板進行計數(shù)。在初次實驗中，對于稀釋的范圍沒有把握，怎樣做才能保證從中選擇出菌落數(shù)在30～300的平板進行計數(shù)？相當于做預實驗。（2）制備培養(yǎng)基（4）微生物的培養(yǎng)與觀察①培養(yǎng)條件：不同種類的微生物，往往需要不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間。細菌一般在30～37℃的溫度下培養(yǎng)1～2d。②觀察：每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結果。防止因培養(yǎng)時間不足而導致遺漏菌落的數(shù)目。③一般來說，在相同的培養(yǎng)條件下，同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征，如形狀、大小和顏色等。（鑒別指示劑）探究實踐：土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)1.結合對照組，分析培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出一些菌落。①判斷培養(yǎng)基是否有雜菌污染：放入未接種的培養(yǎng)基；②判斷選擇培養(yǎng)基是否有篩選作用：放入接種后的完全培養(yǎng)基。2.你是否獲得了某一稀釋度下菌落數(shù)為30~300的平板？在這一稀釋度下，是否至少有2個平板的菌落數(shù)接近？如果得到了兩個或多個菌落數(shù)為30～300的平板，說明稀