核酸化學(xué)理化性質(zhì)

核酸化學(xué)理化性質(zhì)第1頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié).核酸概述第二節(jié).核酸的結(jié)構(gòu)第三節(jié).核酸的物理化學(xué)性質(zhì)第四節(jié).核酸的研究方法第2頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸的理化性質(zhì)第三節(jié)目錄P503第3頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月一、核酸的一般性質(zhì)(了解)①核酸和核苷酸既有磷酸基，又有堿性基團(tuán)，所以是兩性電解質(zhì)，由于磷酸酸性較強(qiáng)常表現(xiàn)酸性。②晶形-DNA為白色纖維狀固體，RNA為白色粉末。③粘度—大多數(shù)DNA為線性分子，分子極不對稱，長度可達(dá)幾厘米，而直徑只有幾納米，所以即使是極稀的DNA溶液，也有極大的粘度，RNA溶液的粘度要小得多。④溶解性：微溶于水(溶液呈酸性)，不溶于一般有機(jī)溶劑，在70%乙醇中形成沉淀==>用70-95%乙醇提純核酸。核苷酸無色、溶于水。

RNA易溶于低鹽(0.14MNaCl)，DNA易溶于高鹽濃度(1MNaCl)。室溫下，稀堿能水解RNA，而DNA穩(wěn)定。稀酸可水解DNA，而濃酸可水解RNA。⑤旋光性-均很強(qiáng)第4頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月二、核酸的水解(P503,掌握)核酸堿基與戊糖形成的N-糖苷鍵。磷酸基與兩種糖分別形成核糖磷酸酯和脫氧核糖磷酸酯。這些糖苷鍵和磷酸酯鍵都能被酸或堿和酶水解。第5頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月糖苷鍵和磷酸酯鍵都能發(fā)生酸水解，但糖苷鍵比磷酸酯鍵更易被酸水解。嘌呤堿的糖苷鍵比嘧啶堿的糖苷鍵對酸更不穩(wěn)定。對酸最不穩(wěn)定的是嘌呤與脫氧核糖之間的糖苷鍵。DNA在pH1.6于37℃對水透析即可完全除去嘌呤堿。在pH2.8于100℃加熱1h，也可完全除去嘌呤堿。水解嘧啶堿需要較高的溫度。用甲酸（98％-100％）密封加熱至175℃2h，無論RNA還是DNA都可以完全水解，產(chǎn)生嘌呤和嘧啶堿，缺點(diǎn)是尿嘧啶的回收率較低。改用三氟乙酸在155℃加熱60min（水解DNA）或80min（水解RNA），嘧啶堿的回收率顯著提高。

1．酸水解第6頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月RNA的磷酸酯鍵易被堿水解，產(chǎn)生核苷酸；用于水解RNA的堿有NaOH和KOH，以KON較好，堿濃度一般為0.3-1mol/L，在室溫至37℃下水解18～24h即可水解完全。DNA的磷酸酯鍵則不易被堿水解。DNA一般對堿穩(wěn)定，在1mol/LNaOH中加熱至100℃4h，可以得到小分子的寡聚脫氧核苷酸。

2．堿水解第7頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月總結(jié)．酸或堿的水解核酸分子中的磷酸二酯鍵可在酸或堿性條件下水解切斷。DNA和RNA對酸或堿的耐受程度有很大差別。例如，在0.1mol/LNaOH溶液中，RNA幾乎可以完全水解，生成2′-或3′-磷酸核苷；DNA在同樣條件下則不受影響。這種水解性能上的差別？與RNA核糖基上2′-OH的鄰基參與作用有很大的關(guān)系。在RNA水解時(shí)，2′-OH首先進(jìn)攻磷酸基，在斷開磷酯鍵的同時(shí)形成環(huán)狀磷酸二酯，再在堿的作用形成水解產(chǎn)物。第8頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月

水解核酸的酶類很多。非特異性水解磷酸二酯鍵的酶稱為磷酸二酯酶，如蛇毒磷酸二酯酶和牛脾磷酸二酯酶。專一水解核酸的磷酸二酯酶稱為核酸酶。3.酶水解第9頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月①按底物專一性分類兩類：以DNA為底物的DNA水解酶（DNases）和以RNA為底物的RNA水解酶（RNases）。②根據(jù)作用方式分兩類：核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶。作用位點(diǎn)在多核苷酸鏈內(nèi)部的為核酸內(nèi)切酶。從多核苷酸鏈的末端開始，逐個(gè)的將核苷酸切下，從而使核酸進(jìn)行降解的酶稱為外切酶。③按磷酸二酯鍵斷裂的方式分兩類：一種是在3’-OH與磷酸基之間斷裂，其產(chǎn)物是5’-核苷酸或寡聚核苷酸。另一種是在5’-OH與磷酸基之間斷裂，其產(chǎn)物是3’-核苷酸或寡聚核苷酸。④其它分類標(biāo)準(zhǔn)還有對底物二級結(jié)構(gòu)的專一性，作用于雙鏈核酸的叫雙鏈酶，作用于單鏈的叫單鏈酶。核酸外切酶作用的方向性，3’→5’或5’→3’。對磷酸二酯鍵兩側(cè)的堿基有無選擇性等。（1）核酸酶的分類第10頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月①牛胰核糖核酸酶（RNaseI）

只作用于RNA，不作用于DNA。且具有極高專一性的酶，其作用位點(diǎn)是嘧啶核苷-3’-磷酸與其他核苷酸之間的鍵（5’-磷酸酯鍵）。產(chǎn)生3’-嘧啶核苷酸或以3’-嘧啶核苷酸結(jié)尾的寡核苷酸。(P503)②核糖核酸酶T1

具有比RnaseI更高的專一性。他作用的位點(diǎn)是3’-鳥苷酸與其相鄰核苷酸的5’-OH之間的連鍵。產(chǎn)生3’-鳥苷酸或以3’-鳥苷酸結(jié)尾的寡核苷酸。③核糖核酸酶T2

主要作用點(diǎn)為Ap殘基，可以將tRNA完全降解成3’-腺苷酸結(jié)尾的寡核苷酸。（2）核糖核酸酶類（RNase）第11頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月①牛胰脫氧核糖核酸酶（DNaseI）切斷雙鏈DNA或單鏈DNA成為以5’-磷酸為末端的寡核苷酸，平均長度為4核苷酸。②牛脾脫氧核糖核酸酶（DnaseII）降解DNA成為3’-磷酸為末端的寡核苷酸，平均長度為6核苷酸。③鏈球菌脫氧核糖核酸酶核酸內(nèi)切酶，作用于DNA，產(chǎn)物為5’-磷酸為末端長度不同的碎片。④限制性內(nèi)切酶在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)，主要降解外源DNA。具有嚴(yán)格的堿基序列專一性。它能專一識別并切割DNA上特定堿基序列，產(chǎn)物仍為雙鏈DNA片段。限制內(nèi)切酶的識別和切割位點(diǎn)通常是4-6bp組成的回文結(jié)構(gòu)。切開后的產(chǎn)物具有粘性末端。限制性內(nèi)切酶在基因工程中得到廣泛應(yīng)用。（4）N-糖苷酶—水解糖苷鍵。（3）脫氧核糖核酸酶（DNase）第12頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月注：生物體內(nèi)存在多種核酸水解酶。這些酶可以催化水解多聚核苷酸鏈中的磷酸二酯鍵。以DNA為底物的DNA水解酶（DNases）和以RNA為底物的RNA水解酶（RNases）。根據(jù)作用方式又分作兩類：核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶。核酸外切酶的作用方式是從多聚核苷酸鏈的一端（3′-端或5′-端）開始，逐個(gè)水解切除核苷酸；核酸內(nèi)切酶的作用方式剛好和外切酶相反，它從多聚核苷酸鏈中間開始，在某個(gè)位點(diǎn)切斷磷酸二酯鍵。在分子生物學(xué)研究中最有應(yīng)用價(jià)值的是限制性核酸內(nèi)切酶。這種酶可以特異性的水解核酸中某些特定堿基順序部位。第13頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸的兩性性質(zhì)及等電點(diǎn)與蛋白質(zhì)相似，核酸分子中既含有酸性基團(tuán)（磷酸基）也含有堿性基團(tuán)（氨基），因而核酸也具有兩性性質(zhì)。由于核酸分子中的磷酸是一個(gè)中等強(qiáng)度的酸，而堿性（氨基）是一個(gè)弱堿，所以核酸的等電點(diǎn)比較低。如DNA的等電點(diǎn)為4～4.5；RNA的等電點(diǎn)為2～2.5。RNA的等電點(diǎn)比DNA低的原因，是RNA分子中核糖基2′-OH通過氫鍵促進(jìn)了磷酸基上質(zhì)子的解離。DNA沒有這種作用。三、核酸的酸堿性質(zhì)(P504,了解)第14頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月堿基的堿性

嘌呤堿基和嘧啶堿基都具有弱堿性。環(huán)內(nèi)氨基的pKa值約為9.5。堿基環(huán)外的氨基（存在于A、G和C）的堿性很弱，在生理pH條件下不能被質(zhì)子化。這種情況與苯胺分子中的氨基相似。因此嘌呤和嘧啶堿基的堿性主要是環(huán)內(nèi)氨基的貢獻(xiàn)。第15頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月四.核酸的紫外吸收(P507，了解)在核酸分子中，由于嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵體系，使DNA和RNA在240～290nm處有強(qiáng)烈紫外吸收，最大吸收峰在260nm左右，可以作為核酸及其組份定性和定量測定的依據(jù)。以A260/A280進(jìn)行定性、定量DNA和RNA溶液中加入溴化乙錠（EB），在紫外下發(fā)出熒光第16頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月第17頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月1.用A260/A280判斷核酸樣品的純度：由于核酸的紫外吸收最大吸收值在260nm處。蛋白質(zhì)最大吸收值在280nm處。利用這一特性，可以鑒別核酸樣品中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)，還可以對核酸進(jìn)行定量測定。用OD260/OD280比值來判斷樣品純度。一般純DNA比值≥1.8，純RNA比值應(yīng)達(dá)到2.0，若含雜蛋白及苯酚，比值會明顯下降。2.對于純的DNA或RNA樣品，可用該法作定量測定

50μg/ml雙鏈DNA通常當(dāng)A260=1.0相當(dāng)于：40μg/ml單鏈DNA（或RNA）

20μg/ml寡核苷酸優(yōu)點(diǎn)：快速、準(zhǔn)確、所需樣品量少OD260的應(yīng)用目錄第18頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月五．核酸的變性、復(fù)性與雜交問：核酸變性與核酸降解的區(qū)別？核酸的變性只涉及雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，并不涉及磷酸二酯鍵的斷裂，所以它的一級結(jié)構(gòu)(堿基順序)保持不變。問：核酸變性后物化性質(zhì)也會發(fā)生哪些變化呢？答案：粘度下降；紫外吸收值A(chǔ)急劇增加；浮力密度升高；酸堿滴定曲線改變；生物活性喪失等。(1)核酸的變性(P508,掌握)1.定義：指高溫、酸堿以及某些變性劑能破壞核酸中的氫鍵，使有規(guī)律的雙螺旋型結(jié)構(gòu)變成單鏈的、無規(guī)律的“線團(tuán)”，這種作用就稱為核酸的變性。第19頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA變性的本質(zhì)是雙鏈間氫鍵的斷裂第20頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月2.引起核酸變性的因素：很多由溫度升高引起的變性稱為熱變性；由酸堿度改變引起的變性稱酸堿變性；變性試劑如尿素、甲醛、胍類、酰胺以及某些有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮等均可引起核酸的變性。第21頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA的熔點(diǎn)其中DNA的熱變性一般在較窄的溫度范圍內(nèi)發(fā)生，很像固體結(jié)晶物質(zhì)在其熔點(diǎn)突然熔化的情況。因此通常把加熱變性使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時(shí)的溫度稱為熔點(diǎn)或溶解溫度，用Tm表示。一般DNA的Tm值在82-95

C之間。第22頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA變性是個(gè)突變過程，類似結(jié)晶的熔解。的溫度稱熔解溫度。通常將紫外吸收的增加量達(dá)到最大增量一半（即加熱變性使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半）時(shí)的溫度稱為該DNA的熔點(diǎn)或熔解溫度(meltingtemperature,Tm)。TmTm第23頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月熱變性解鏈曲線：如果在連續(xù)加熱DNA的過程中以溫度對A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm處的吸光率）值作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線。目錄第24頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月第25頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月Tm：變性是在一個(gè)相當(dāng)窄的溫度范圍內(nèi)完成，在這一范圍內(nèi)，紫外光吸收值達(dá)到最大值的50%時(shí)的溫度稱為DNA的解鏈溫度，又稱融解溫度(meltingtemperature,Tm)。其大小與G+C含量成正比。目錄第26頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月①DNA的均一性均一性越高，DNA的解鏈溫度越窄。均質(zhì)DNA熔解過程發(fā)生在一個(gè)較小的溫度范圍內(nèi)；異質(zhì)DNA的熔解過程發(fā)生在一個(gè)較寬的溫度范圍內(nèi)。Tm值可作為衡量DNA樣品均一性的標(biāo)準(zhǔn)。②G-C的相對含量越多，Tm值越高。G和C的含量高，Tm值高。因而測定Tm值，可反映DNA分子中G,C含量，可通過經(jīng)驗(yàn)公式推算Tm值或G-C含量：（G+C)%=（Tm-69.3）×2.44問：DNA的Tm值與哪些因素有關(guān)呢？第27頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月③介質(zhì)中的離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度較低，DNA溶解溫度較低，且溶解溫度范圍較寬。離子強(qiáng)度較高，DNA溶解溫度較高，且溶解溫度范圍較窄。故DNA不應(yīng)保存在極烯的溶液中。④pH值的影響高pH下堿基廣泛去質(zhì)子而喪失形成氫鍵的能力。⑤變性劑的影響如甲酰胺、尿素、甲醛等破壞氫鍵，妨礙堿基堆積，使Tm下降。第28頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月由于RNA本身只有局部的雙螺旋區(qū)，所以變性行為所引起的性質(zhì)變化沒有DNA那樣明顯。具體：變性曲線不那么陡，Tm值也較低。利用紫外吸收的變化，可以檢測核酸變性的情況。例如，天然狀態(tài)的DNA在完全變性后，紫外吸收(260nm)值增加25－40%.而RNA變性后，約增加1.1%。這種現(xiàn)象稱為增色效應(yīng).3.RNA的變性第29頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月變性后的核酸在260nm處的紫外吸收明顯升高，稱增色效應(yīng)。核酸復(fù)性后，光吸收值又回復(fù)到原有水平（減色效應(yīng)）。這是檢測核酸變性的一個(gè)最簡便的方法。思考：增色效應(yīng)的原因？當(dāng)核苷酸摩爾數(shù)相同時(shí)，A260值大小如下關(guān)系：單核苷酸>單鏈DNA>雙鏈DNA4.增色效應(yīng)的原因(P508)第30頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA復(fù)性的定義在適當(dāng)條件下，變性DNA的兩條互補(bǔ)鏈可恢復(fù)天然的雙螺旋構(gòu)象，這一現(xiàn)象稱為復(fù)性。減色效應(yīng)：

DNA復(fù)性時(shí)，其溶液OD260降低。熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，這一過程稱為退火(annealing)。退火溫度＝Tm－25℃目錄(2)核酸的復(fù)性(P508,掌握)第31頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA復(fù)性的程度、速率與復(fù)性過程的條件有關(guān)。將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫時(shí)，DNA不可能復(fù)性。但是將變性的DNA緩慢冷卻時(shí)，可以復(fù)性。復(fù)性影響因素：分子量越大復(fù)性越難。濃度越大，復(fù)性越容易。此外，DNA的復(fù)性也與它本身的組成和結(jié)構(gòu)有關(guān)。第32頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月影響復(fù)性速度的因素：（1）溶液溫度的高低（Tm–25℃）（2）單鏈片段的大?。?）單鏈片段濃度（4）片段內(nèi)重復(fù)序列的多少（5）溶液離子強(qiáng)度的大小第33頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月附：DNA的復(fù)性一般只適用于均一的病毒和細(xì)菌的DNA，至于哺乳動物細(xì)胞中的非均一DNA，很難恢復(fù)到原來的結(jié)構(gòu)狀態(tài)。這是因?yàn)楦髌瑪嘀g只要有一定數(shù)量的堿基彼此互補(bǔ)，就可以重新組合成雙螺旋結(jié)構(gòu)，堿基不互補(bǔ)的區(qū)域則形成突環(huán)。復(fù)性速度的因素影響：順序簡單的DNA分子比復(fù)雜的分子復(fù)性要快；DNA濃度越高，越易復(fù)性；此外，DNA片斷大小、溶液的離子強(qiáng)度等對復(fù)性速度都有影響。復(fù)性后DNA的表現(xiàn)：物理化學(xué)性質(zhì)能得到恢復(fù)，如紫外光吸收值下降，粘度增高，比旋增加，生物活性也得到部分恢復(fù)。第34頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA復(fù)性第35頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月A.概念:在DNA變性后的復(fù)性過程中，如果將不同種類的DNA單鏈分子或RNA分子放在同一溶液中，只要兩種單鏈分子之間存在著一定程度的堿基配對關(guān)系，在適宜的條件（溫度及離子強(qiáng)度）下，就可以在不同的分子間形成雜化雙鏈(heteroduplex)這種雜化雙鏈可以在不同的DNA與DNA之間形成，也可以在DNA和RNA分子間或RNA與RNA分子間形成。這種現(xiàn)象稱為核酸分子雜交1.核酸分子雜交的概念和原理(了解)(3)核酸的分子雜交(hybridization)

簡單來說：在退火條件下，不同來源的DNA互補(bǔ)區(qū)形成氫鍵，或DNA單鏈和RNA鏈的互補(bǔ)區(qū)形成DNA-RNA雜合雙鏈的過程?？尚纬蒁NA—DNA雙鏈分子；DNA—RNA雙鏈分子；RNA—RNA雙鏈分子。第36頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月B.原理:是只要兩種單鏈分子之間存在著一定程度的同源性，在適宜的條件（溫度及離子強(qiáng)度）下，就可以按照堿基互補(bǔ)配對原則，在不同的分子間退火形成雜化雙鏈。第37頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月第38頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2