針葉樹離體培養(yǎng)與植株再生技術研究進展

針葉樹離體培養(yǎng)與植株再生技術研究進展

針葉樹的遠離體培養(yǎng)和植物育種是植物組織培養(yǎng)研究中很難解決的一個領域。隨著人們對無性系林業(yè)的日益重視,世界各國對針葉樹的組織培養(yǎng)給予了特別關注。經(jīng)過近20年的發(fā)展,針葉樹已從組織、器官培養(yǎng)深入到細胞、原生質(zhì)體培養(yǎng)逐步實現(xiàn)從理論研究到應用實踐的跨越,尤其在離體培養(yǎng)與植株再生各環(huán)節(jié)技術指標上取得了重大突破。然而縱觀全球針葉樹組織培養(yǎng),僅有少數(shù)幾個樹種的體胚發(fā)生技術在生產(chǎn)上得到應用大部分組織培養(yǎng)技術仍停留在實驗室研究階段尤其是在松屬樹種中仍存在不少困難。火炬松(PinustaedaL.)是針葉樹中少數(shù)幾個組織培養(yǎng)技術相對成熟的樹種之一,系統(tǒng)了解其培養(yǎng)技術研究及應用進展,對同類樹種相關研究的開展具有借鑒意義?；鹁嫠稍a(chǎn)美國東南部,是世界南方松中分布最廣、生長面積最大、木材年產(chǎn)量最高、蓄積量最多的綠化和造林用速生針葉樹種,上世紀30年代引入我國,目前已成為我國南方省區(qū)大面積造林的重要經(jīng)濟樹種。火炬松的組織培養(yǎng)研究始于上世紀70年代。1987年Gupta和Durzan首次從改良的MS培養(yǎng)基上,以未成熟合子胚為外植體,獲得火炬松體細胞胚和再生植株。之后,對火炬松不定芽誘導、體細胞胚發(fā)生和植株再生技術的研究不斷深入,并取得了很大進展。1體胚發(fā)生途徑通過組織培養(yǎng)獲得火炬松再生植株有器官發(fā)生和體細胞胚胎發(fā)生2種途徑。器官發(fā)生包括直接發(fā)生和間接發(fā)生2種方式,直接器官發(fā)生耗時短操作簡便。間接器官發(fā)生需先誘導愈傷組織,再經(jīng)器官分化形成再生植株,愈傷組織培養(yǎng)不受季節(jié)限制,污染率低,誘導率高。體胚發(fā)生途徑則多通過間接方式發(fā)生,即先誘導生成胚性愈傷組織(胚性胚柄團),再從胚性愈傷組織誘導體細胞胚并使其成熟和萌發(fā),進而得到完整植株。通過體胚發(fā)生獲得再生植株的優(yōu)點是,在一個培養(yǎng)物上所能發(fā)生的胚狀體數(shù)量往往比不定芽數(shù)多,且發(fā)生速度快,結(jié)構(gòu)完整,無需誘導生根環(huán)節(jié),成苗率高。對于火炬松,這2種發(fā)生途徑都有其重要意義。1.1再生植株的選擇火炬松的組織培養(yǎng)研究始于上世紀70年代。之后相繼有研究以成熟合子胚為外植體直接誘導形成不定芽,并經(jīng)根的誘導獲得了再生植株(闕國寧等1997;唐巍等1997;Tang和Guo2001)。唐巍和歐陽藩(1998)還通過成熟合子胚培養(yǎng)獲得了器官性愈傷組織,從愈傷組織誘導不定芽,并誘導芽苗生根獲得了再生植株,不定芽的誘導率達58.2%,生根率達46%。1.2生理生化及生物學研究1987年Gupta和Durzan以火炬松未成熟合子胚為外植體,首次經(jīng)體胚發(fā)生途徑獲得再生植株。此后,有關研究大量開展,火炬松體胚發(fā)生再生植株成功的研究越來越多,生理生化及分子生物學方面的研究也得以深入(Becwar等1990;唐巍等1998)。其中唐巍等(1998)以24個火炬松基因型成熟種胚為外植體,獲得完整植株,成活率最高達25%。在此基礎上,生物反應器、低溫冷藏技術及人工種子生產(chǎn)等應用研究也得以迅速發(fā)展。這些技術的發(fā)展也大大促進了火炬松體胚發(fā)生植株再生技術的應用。據(jù)報道,美國Weyerhaease公司和Westvaco公司已將火炬松體胚發(fā)生技術應用于苗木商業(yè)化生產(chǎn)。2影響植物再生的主要因素是火炬松離體培養(yǎng)火炬松組織培養(yǎng)過程受多種因素的影響,了解這些影響因素的作用規(guī)律將有利于火炬松的快速繁殖和工業(yè)化生產(chǎn)。2.1體胚誘導發(fā)育的期次到目前為止,火炬松成功的離體培養(yǎng)所使用的外植體均為合子胚。器官發(fā)生植株再生以成熟的合子胚為外植體,不定芽或器官性愈傷組織通常發(fā)生于子葉或下胚軸(Tang和Guo2001;闕國寧等1997)。體胚發(fā)生多以幼嫩合子胚為外植體,發(fā)育早期太小的合子胚不容易剝離,此時可用包含合子胚的雌配子體接種(Gupta和Durzan1987)。合子胚的發(fā)育階段是影響體胚發(fā)生的一個主要因素,通常適合體胚誘導的發(fā)育階段只是一個很短的時間。Becwar等(1990)研究發(fā)現(xiàn),7月6日到8月3日取材的合子胚上獲得體胚的最高誘導率,同時發(fā)現(xiàn)體胚誘導與合子胚的形態(tài)學密切相關,合子胚長度小于0.5mm時(在子葉原基發(fā)育之前)最適合誘導體胚。唐巍等于1998年打破了幼嫩合子胚發(fā)育狀態(tài)和取材季節(jié)的束縛,首次以成熟合子胚為外植體建立了體胚發(fā)生和植株再生技術體系,盡管再生頻率只有6.1%~18.4%。2.2火炬松體胚的誘導不同基因型的外植體需要的最適培養(yǎng)條件不同,而在相同誘導條件下,其不定芽誘導和體胚發(fā)生情況有明顯差異。對3種基因型(Hb、Ma和Mc)火炬松不定芽誘導的研究發(fā)現(xiàn),不同基因型不定芽的分化、伸長、生根情況有顯著差異。其中,基因型Hb的不定芽分化率最高,達58.2%;不定芽的伸長生長速率以Ma最快,達0.05cm·d對火炬松8個自由授粉家系體胚發(fā)生的研究發(fā)現(xiàn),家系E-440單位體積培養(yǎng)物獲得的胚性培養(yǎng)物數(shù)量最多。對3個家系進行的研究也表明在相同培養(yǎng)條件下,不同家系胚性愈傷組織的誘導率、體細胞胚的得率均有所不同(Tang等2001a)。MacKay等(2006)對火炬松不同家系體胚誘導的研究也得出上述相似的結(jié)論。同時還發(fā)現(xiàn),在體胚發(fā)生起始時存在很強的遺傳累積效應和母體效應因此在取材時選擇優(yōu)良的親本特別是母本至關重要。2.3火炬松胚性愈傷組織種培養(yǎng)基培養(yǎng)基是植物組培最重要的基質(zhì),不同培養(yǎng)基由于其營養(yǎng)成分及含量不同,培養(yǎng)效果也有所不同。Tang等(1998)在使用不同倍性TE培養(yǎng)基(0.5、0.75、1.0、1.25和1.5倍TE培養(yǎng)基)誘導火炬松成熟合子胚不定芽的分化時發(fā)現(xiàn),1.25倍的TE培養(yǎng)基上不定芽分化率最高(73.5%),每個胚上芽數(shù)最多(3.9個),在間接不定芽誘導研究中,也得出相似的結(jié)論(唐巍和歐陽藩1998)。闕國寧等(1997)研究發(fā)現(xiàn),總含鹽量、總含氮量以及NHBecwar等(1990)在對火炬松胚性愈傷組織的誘導研究中發(fā)現(xiàn),在其他條件相同時,降低鹽濃度的改良MS培養(yǎng)基(MSG)上誘導率最高,其次是DCR培養(yǎng)基。Li等(1998a)也發(fā)現(xiàn),DCR1、LP和BM1三種培養(yǎng)基中,BM1培養(yǎng)基比DCR1誘導率高,但LP對誘導無效。Tang等在2001(a)年深入研究了不同營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基對火炬松體胚發(fā)生的影響,研究中使用了DCR、B5、LP、MSG、改良MS、SH、TE和LOB等8種基本培養(yǎng)基,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在其他條件相同情況下,胚性愈傷組織誘導的最高頻率發(fā)生在改良MS培養(yǎng)基和LOB培養(yǎng)基上。大量研究表明,火炬松器官發(fā)生和體胚發(fā)生受培養(yǎng)基中無機鹽濃度的影響較大。器官發(fā)生要求培養(yǎng)基中存在較高濃度的Mg2.4體胚的誘導、脫落酸和關于ba植物生長調(diào)節(jié)劑在離體培養(yǎng)形態(tài)發(fā)生過程中起著不可替代的作用。在火炬松不定芽的形成中使用較多的是6-芐氨基腺嘌呤(6-benzylaminopurine,BA);培養(yǎng)基中添加適宜濃度組合的2,4-二氯苯酚代乙酚(2,4-D)、BA和激動素(kinetin,KT)時,體胚誘導情況較好,而在體胚成熟階段則必須有脫落酸(abscisicacid,ABA)的存在。Silveira等(2004)在研究與細胞生長有關的生物化學和生理參數(shù)時進一步從理論上證實了這一點。2.4.1生長素的提取火炬松不定芽的誘導要求適當濃度的生長素與細胞分裂素配合使用,最常用的生長素是萘乙酸(1-naphthlceticacid,NAA)和3-吲哚丁酸(3-indolebutyricacidIBA),使用濃度一般不超過1mg·L2.4.2火炬松體胚的生長調(diào)節(jié)劑炬松體胚發(fā)生也要求適當濃度的生長素和細胞分裂素配合使用,2,4-D是誘導體胚發(fā)生最常用也最有效的生長素,其次是IBA和NAA,細胞分裂素多使用BA或KT(Li等1998a;Tang等2001a)。Tang等(2001a)對火炬松體胚發(fā)生不同階段適合的生長調(diào)節(jié)劑做了具體研究,發(fā)現(xiàn)在胚性愈傷組織誘導階段,8mg·L適當濃度的ABA對火炬松體細胞胚的成熟是必須的。研究發(fā)現(xiàn),低濃度的ABA(10mg·L2.5peg與聚乙二醇糖類是培養(yǎng)基上最常用的滲透調(diào)節(jié)劑,不同糖類在離體培養(yǎng)中會起到不同的效果。Tang等(2008)發(fā)現(xiàn),分化培養(yǎng)基中添加2%葡萄糖時火炬松不定芽誘導率最高(83.7%),每個胚上不定芽數(shù)最多(5.8個),誘導效果明顯好于甘露糖、果糖和山梨糖。與糖類相比,聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)是一種不發(fā)生胞質(zhì)分離的滲透劑。改變肌醇濃度也可起到調(diào)節(jié)滲透壓的作用。通常需將火炬松胚性組織轉(zhuǎn)移到添加PEG或提高肌醇濃度的培養(yǎng)基上,以促進體胚的成熟(Tang等1998)。有數(shù)據(jù)顯示,如果成熟培養(yǎng)基中不含PEG,多數(shù)體胚停留在早期階段不能進一步成熟,促進體胚成熟的最適PEG濃度是5%~7.5%(Li等1997,1998b);而13%PEG8000能夠明顯促進火炬松體胚萌發(fā)(Pullman等2003)。體胚在成熟后期到萌發(fā)之前,對滲透壓也有嚴格要求。體胚需通過機械方法或延長培養(yǎng)時間的方法來進行部分干化。若不經(jīng)干化處理,體胚很難形成功能性的芽分生組織,植株的成活率低(Tang等2001a)。2.6細胞懸浮培養(yǎng)火炬松植株再生不定芽發(fā)生途徑中一般以固體培養(yǎng)基為宜,固化劑多使用0.7%瓊脂,而2g·L在火炬松體胚發(fā)生過程中,用愈傷組織建立起的細胞懸浮培養(yǎng)系,細胞可保持活性達4個多月,細胞密度與體胚增殖速率有直接關系,最適宜的密度是1mL細胞壓積(packedcellvolume)(Tang2001)。有研究認為,在固體培養(yǎng)基上覆蓋一層液體培養(yǎng)基時,火炬松胚性愈傷組織的誘導率顯著增加,當將固體培養(yǎng)基中NAA的濃度從2mg·L2.7火炬松體胚的附加成分很多附加成分以適當方式加入培養(yǎng)基后可以在一定程度上改善火炬松體胚培養(yǎng)效果,而有的附加成分則是培養(yǎng)所必須的。例如,在火炬松體胚發(fā)生中,高濃度的肌醇、L-谷氨酰胺、水解酪蛋白和5.0mg·L2.8培養(yǎng)有利于奏益物的不斷誘導光照和溫度是影響火炬松離體培養(yǎng)的主要環(huán)境因素。在直接不定芽誘導中,暗培養(yǎng)有利于不定芽原基的誘導,不定芽的分化、伸長和生根等則需要光照,培養(yǎng)溫度以(23±1)℃為宜(唐巍等1997)。在間接不定芽發(fā)生途徑中,愈傷組織的誘導可在黑暗條件下進行,不定芽的分化則在14h·d3栽植時環(huán)境條件、基質(zhì)與其他針葉樹相似,高度適宜、健康強壯的火炬松試管苗即可用于移栽。移栽前應先在自然光下瓶內(nèi)煉苗數(shù)天,移栽時小心清洗根部附著的培養(yǎng)基,移栽后要注意溫度、光照等環(huán)境條件的逐漸過渡,特別是濕度條件。在移栽初期,通常覆蓋塑料薄膜以保持較高濕度,之后逐漸撤除薄膜直至苗木完全暴露于自然條件下。移栽基質(zhì)多選用珍珠巖:泥炭蘚:蛭石=1:1:1(V/V/V)的混合基質(zhì)。試管苗的成活率與其移栽前的生長狀況和煉苗情況密切相關,研究表明,高于3cm的健康植株馴化時間為16d時,再生植株的成活率最高(Tang等2001a)。4火炬松葉片發(fā)育時期遺傳轉(zhuǎn)化是植物組織培養(yǎng)應用的一個主要方面,但就針葉樹而言,成功獲得轉(zhuǎn)化目的基因植株的例子并不多,火炬松也是如此?；鹁嫠蛇z傳轉(zhuǎn)化上使用過的方法有兩種,即農(nóng)桿菌介導和粒子轟擊。目前,由于限制條件較多且操作復雜,粒子轟擊的方法使用較少。Sederoff等1986年首次成功進行了火炬松基因轉(zhuǎn)化,他們通過農(nóng)桿菌介導法將細菌基因轉(zhuǎn)入了火炬松。之后陸續(xù)有火炬松遺傳轉(zhuǎn)化的嘗試但多數(shù)研究只獲得轉(zhuǎn)報告基因的瞬時表達。Tang等(2001b)通過土壤農(nóng)桿菌與外植體共培養(yǎng)的方法首次從火炬松獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植株,火炬松遺傳轉(zhuǎn)化的研究才有了突破性進展。使用根癌農(nóng)桿菌株LBA4404[含有質(zhì)粒pBIGM(帶有Mt1D和GutD)]感染火炬松的成熟合子胚,在含有15mg·L火炬松轉(zhuǎn)化基因的表達率受多種因素影響。Tang等(2001b)選擇土壤農(nóng)桿菌株GV3101(含質(zhì)粒pPCV6NFHyg-GUSINT)來轉(zhuǎn)化火炬松的7個家系發(fā)現(xiàn)家系11-1029獲得最高頻率的GUS表達(100%),每個胚上藍斑數(shù)達300個。在共培養(yǎng)成熟胚的子葉、下胚軸、胚根和共培養(yǎng)成熟合子胚的愈傷組織和芽中發(fā)現(xiàn)了GUS報告基因的表達。通過PCR分析、Southern雜交,結(jié)合DNA/T-DNA分析證實,外源基因成功整合到了火炬松中。除外植體的基因型外,轉(zhuǎn)化率還受共培養(yǎng)時間、處理方法、農(nóng)桿菌菌株的影響,使用改良的農(nóng)桿菌株EHA105與火炬松成熟合子胚共培養(yǎng)的研究發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)21d,使用pCAMBIA1301和pTOK47并用超聲波處理的轉(zhuǎn)基因植株中GUS表達率最高(Tang2003;Tang等2004)。Tang和Vanessa在20