中藥化學成分的研究進展

中藥化學成分的研究進展

中藥（tcm）及其補充是中國早期醫(yī)生經過長期實踐積累的寶貴資產。作為一種重要的藥物資源，它被用作疾病的預防和治療。幾千年來，它一直是一個重要的藥物資源。近來也吸引西方國家對其進行越來越多的研究和應用1藥代動力學中藥藥代動力學是借助于動力學原理,研究中藥單方制劑、復方制劑、中藥制品、中藥提取物中的效應成分、毒性成分、及代表性成分等在體內吸收、分布、代謝和排泄(Absorption,Distribution,MetabolismandExcretion,ADME)的動態(tài)變化規(guī)律及其體內時-量或時-效關系,并用數學模型提供藥代動力學參數的一門學科2藥代動力學研究中藥用于疾病的預防和治療已有幾千年的歷史,有效性已得到驗證。那么,中藥是哪些效應成分進入體內發(fā)揮作用?這些成分如何從體外吸收進入體內?如何在體內分布、代謝和排泄?這些都是目前亟待闡明的關鍵科學問題。為闡明這些科學問題,中藥的藥代動力學研究應運而生。中藥藥代動力學研究的目的和意義主要表現在以下幾個方面。2.1藥動-藥相結合的方法中藥能夠產生藥理作用,產生療效,其作用無論來自本身存在的化學物質,組方配伍后產生出新的物質,通過機體作用產生出代謝產物,還是調動在體的化學物質或機體的反應系統(tǒng)產生藥理作用,必定存在一定的物質基礎及作用機制。通過研究中藥體內過程的動態(tài)變化規(guī)律,可以闡明中藥藥效物質基礎及作用機制,為中藥傳統(tǒng)理論提供科學的闡釋。此處以藥動-藥效相結合的方法研究雙黃連口服液抗菌作用藥效物質基礎為例,來介紹這一問題的研究思路,如圖1。將雙黃連口服液濃縮后灌胃給予大鼠,在無菌條件下采集不同時間點的血清。一部分血清用來做抑菌活性試驗,評價其體內藥效動力學過程,抗菌效應成分在體內的濃度隨時間變化,其濃度高,在培養(yǎng)皿上的抑菌斑就大,抑菌斑直徑的對數值與藥物濃度呈線性關系,抑菌斑直徑對數值隨時間變化曲線就相當于藥效-時間曲線。另一部分血清用來研究雙黃連口服液指紋圖譜中的指紋特征成分的體內動態(tài)變化規(guī)律,即檢測入血成分,各成分指紋峰的峰面積大小代表其血藥濃度高低,峰面積隨時間的變化作為成分的血藥濃度-時間曲線。將各成分的血藥濃度-時間曲線和藥效-時間曲線作對比,選擇達峰時間和半衰期比較接近藥效-時間曲線的成分,比如圖2中E成分的血藥濃度-時間曲線和藥效-時間曲線很接近,就可將E分離出來,驗證是否有藥效,這樣可以提高篩選有效成分的速度。實驗結果示意圖見圖2。2.2為中藥復方藥物相互作用提供發(fā)揮依據中藥復方較為復雜,有關中醫(yī)藥的理論較多,如:整體觀、辨證論治、臟腑學說、君臣佐使等等,這些屬于中醫(yī)藥獨特的理論體系和精髓。近年來,有研究者提出“藥對”學說,藥對是中醫(yī)臨床常用的相對固定的兩藥味的配伍組合,是中藥配伍應用中的最小單元,“藥對”的配伍機制,多從藥物相互作用的角度來解釋。藥物相互作用的發(fā)生機制有多種藥物間相互作用原理也可闡釋中藥復方配伍機制。以甘草配伍為例,甘草是最常用的中藥材之一,是很多中藥復方中具有代表性的“使藥”,發(fā)揮藥物-藥物相互作用。甘草在治療疾病中與其它中藥配伍主要發(fā)揮以下三種作用:(1)增強其他中藥的藥效;(2)降低其他中藥的毒性;(3)對中藥復方進行調味矯味。它的作用原理見圖5從整體觀點出發(fā)研究中藥的藥代動力學特征,可以為組方配伍原理提供科學依據。本課題組利用大鼠研究了雙花百合片(ShuanghuaBaiheTablets,SBT)中小檗堿及其它成分與苦地丁中紫堇靈之間的藥物-藥物相互作用2.3保證治療組織化和療效長期以來,中藥多以經驗給藥或辨證用藥為主,多數情況缺乏藥代動力學研究資料的支持。通過中藥藥代動力學研究可明確中藥中有效成分在體內吸收、分布、代謝、排泄等過程的動態(tài)變化規(guī)律,獲得其藥動學參數,從而可以科學地擬定給藥方式、給藥劑量、給藥間隔及確定療程,從而可提高其臨床整體治療水平。以黃楊寧(CyclovirobuxineD)片為例,它是黃楊科植物小葉黃楊所含的一種生物堿制劑,已上市多年。q其說明書中的用藥方式為口服,1次2mg,1日3次。該藥物治療心絞痛臨床效果好,但是按照說明書連續(xù)使用1周左右后會出現四肢麻木,頭暈等副作用。部分醫(yī)生將黃楊寧片的服藥方式改成:連續(xù)用藥5天,停藥2天,然后再連續(xù)用藥5天。這種服藥方式不但保證了黃楊寧片的療效,而且基本避免了其副作用。根據此種現象,研究人員進行了如下研究,給6例健康志愿者單次口服2mg黃楊寧片,繪制血漿平均藥-時曲線,半衰期為33.8h;再按照黃楊寧片的說明書連續(xù)給藥5天,第6天采血,繪制平均藥-時曲線,結果2.4制劑的選擇中藥及其提取物的制劑研發(fā)需要制定合理的給藥途徑和藥物劑型,其需要結合體內藥效和體內藥代研究來確定。甘利欣,是甘草酸二銨的注射劑,臨床用于慢性病毒性肝炎的治療效果非常明顯,市場銷量很好。甘利欣做成注射劑非常合適,若做成口服制劑,則吸收較差,該藥物的藥代動力學實驗研究顯示其絕對生物利用率僅有3%左右,因此口服給藥不是甘利欣(甘草酸二銨)合適的給藥途徑。因此,只有通過體內藥代研究,才能提供最直接的給藥途徑或劑型選擇的依據,才能真正達到中藥制劑的質量可控、高效、低毒的目的。2.5方原理和配伍規(guī)律中藥藥代動力學研究不僅可以揭示藥效物質基礎、方劑組方原理和配伍規(guī)律;還為初步化學成分篩選、劑型設計、質量評估和給藥方案制訂提供依據,故能夠提高藥物的臨床控制程度,更好地指導臨床用藥,推動中藥的現代化和國際化3中藥藥代動力學研究的特殊性和難點由于中藥化學成分的復雜性、中藥藥效的多效性和中醫(yī)臨床應用的辨證施治及復方配伍的中醫(yī)特色等特點,使得中藥藥動學研究有別于化學藥藥動學研究,有其特殊性和復雜性3.1化學成分含量極微中藥成分的復雜性,表現在單味中藥含有多種成分,復方成分更為復雜,且配伍后的各成分可能發(fā)生變化。中藥是一個復雜的體系,不論是單味中藥還是中藥復方,均為含有大量化學成分,而且有些成分含量極微。這些客觀存在的問題均構成其藥效學和藥代動力學研究的難點,其原因可能是發(fā)揮藥效是多種成分相互作用產生的綜合結果,難以系統(tǒng)、全面地分析中藥藥效作用的物質基礎。3.2生物樣品測定難多數中藥發(fā)揮藥效作用的物質基礎尚不確定,使藥代動力學研究的目標化學成分選擇困難;目標化學成分在復方中的含量低,其血、尿和組織中的濃度無法檢測;多種成分同時吸收入血,其體內代謝物均可能干擾測定,這增加了生物樣品測定的難度;因中藥材的特殊性,中藥制劑中所含成分的含量往往不確定,只規(guī)定含量不低于某個值,而藥動學研究是需要確定劑量的,劑量不同藥動學特征有可能不同,這也給藥代動力學研究增加了難度。中藥藥代動力學與化學藥藥代動力學的研究方法比較見表1。3.3中藥的整體觀中藥的藥效往往是多種化學成分相互作用所產生的綜合效果,其復雜性導致藥動學測定指標選擇困難,到底選擇哪些指標能代表該中藥的藥效往往是一個難以定論的問題。中藥藥動學研究必須考慮中藥配伍的真正內涵,辨證論治,君臣佐使等原則是中醫(yī)用藥的精髓,因而整體觀思想應該在中藥藥動學研究中體現。因此,如何從體整體觀研究中藥藥代動力學是一挑戰(zhàn)。4中醫(yī)學現代動力學研究方法中藥藥代動力學的研究方法包括藥物濃度法、生物效應法以及中藥藥代動力學研究的新理論、新方法,如整體藥動學。最常用的是藥物濃度法。4.1室分析方法學或生理藥動學模型該法通過測定給藥后不同時間的血藥濃度,得到血藥濃度-時間數據,然后通過房室分析或非房室分析方法學或生理藥動學模型,計算藥動學參數,從而闡明效應成分在體內的動態(tài)變化規(guī)律。此法適用于效應成分明確的中藥或中藥制劑的藥動學研究,也是評價藥代動力學特征最常用最準確的一種方法。該法對于新藥開發(fā)、中藥作用機制的闡明及臨床合理用藥具有重要的意義。有學者4.2高效液相色譜前處理主要包括高靈敏度、高通量的生物樣品分析技術和中藥多組份同時定量分析技術。中藥制劑中成分多種多樣,且結構較為復雜,含量一般都很低。進人體內后,原藥及代謝物在血漿、膽汁、尿液等體液中的含量往往只有ng或pg級水平。一般的方法如高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)等難以檢測,且前處理操作繁瑣,從基質中分離的難度也很大。液相色譜與質譜串聯的技術(LC-MS)將色譜技術的高分離能力與質譜技術的高靈敏,及結構解析能力成功結合,成為應用廣泛、潛能巨大的分析技術,為中藥藥動學的快速測定分析提供了一個重要技術手段。中藥人體藥代動力學的試驗流程一般為:文獻調研、預試驗→選擇具有代表性的有效成分→臨床試驗方案設計→預試驗確定分析成分、采血點和線性范圍→臨床試驗方案修訂→分析方法方案設計→方法學確證→正式臨床試驗→分析測定生物樣品→數據統(tǒng)計分析及藥動學評價→試驗報告。4.3中藥復方制劑的臨床試驗采樣點的確定對藥代動力學研究結果具有重大的影響,在進行中藥復方制劑的藥動學臨床試驗時,因中藥成分復雜,采樣點的設計要兼顧多個有效成分,必要時需進行多個臨床試驗。具體參照臨床藥代動力學研究技術指導原則中的規(guī)定開展試驗。5典型實例：雙花百合成像組人體藥代動力學5.1雙花百合片本片雙花百合片是揚子江藥業(yè)的上市品種,由黃連、苦地丁、板藍根、紫草、金銀花、淡竹葉、蛇膽、地黃、百合、細辛10味中藥組成,其君臣佐使關系見圖8。雙花百合片于2012年獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局的生產批件(國藥準字Z20123033)。本品為薄膜衣異型片,除去薄膜衣后顯棕黑色;氣清香,味苦。主要功能為清熱瀉火,解毒涼血。用于輕型復發(fā)性口腔潰瘍心脾積熱證,癥見口腔粘膜反復潰瘍,灼熱疼痛,口渴,口臭,舌紅苔黃等。含量測定規(guī)定小檗堿的含量不得少于18mg/片。5.2復方中藥中的效應成分測定,俄根據君臣佐使的關系,查找文獻進行調研。首選中藥質量標準中檢測和鑒別的化學成分,當質量標準中沒有明確定量成分和鑒別成分時,則按照以下順序確定藥動學檢測成分:第一步,按中藥配伍的君、臣、佐、使的先后順序,從文獻中分別檢索與中藥說明書中藥效一致的單味藥材中的效應成分;第二步,對復方中成藥進行含量測定,確定“第一步”中檢索到的各化學成分是否在制劑中可以檢測到,含量如何;第三步,用大鼠或人進行預實驗,確定制劑中可以檢測到的成分哪些是可以吸收入血的;最后將吸收入血成分確定為藥動學研究對象。按照上述方法檢索雙花百合片的化學成分,主要為生物堿類、醌類、有機酸和其他類成分。其中君藥黃連主要是小檗堿成分,臣藥苦地丁主要成分為紫堇靈和乙酰紫堇靈,臣藥紫草主要成分為紫草素和乙酰紫草素,佐藥金銀花主要成分是綠原酸和木犀草素,佐藥蛇膽主要成分為牛黃酸。5.2.1esi負離子型化合物對雙花百合片進行提取,流程見圖9,利用LC-TOF/MS分析技術在雙花百合片中尋找鑒定上述化學成分,并進行定性分析和結構解析。ESI正離子模式下,鑒別出17個化合物,兩個未知化合物,這些化合物多為生物堿類成分,源于君藥黃連和臣藥苦地丁兩味藥材;ESI負離子模式下,鑒別出16個化合物,分別來自于佐藥金銀花和蛇膽。將雙花百合片灌胃給予大鼠后,觀察大鼠血漿和尿液樣品中是否能找到上述鑒定的33個化合物,再結合文獻調研和LC-MS/MS分析結果,選擇了11個與復方藥理作用相關的入血活性成分作為雙花百合片復方的指標成分,這11個指標成分分別為:小檗堿、表小檗堿、小檗紅堿、木蘭花堿、黃連堿、巴馬汀、藥根堿、紫堇靈、乙酰紫堇靈、綠原酸和?；悄懰?各指標性成分的結構式見圖10和圖11。5.2.2材料1.5.4%的合成測定雙花百合片中入血成分的含量,測得雙花百合片(批號:14032311,規(guī)格:0.6g/片)每片中11個指標性成分的各成分含量如下:小檗堿18.01堿量(合片(批號:、黃連堿5.11堿量(合片(批號、表小檗堿5.38堿量(合片(批號、藥根堿2.42±0.07mg、木蘭花堿1.90±0.07mg、小檗紅堿1.04±0.07mg、巴馬汀4.92±0.07mg、紫堇靈0.465±0.07mg:學、乙酰紫堇靈0.061±0.07mg:學、綠原酸0.91±0.07mg和?；悄懰?.62±0.07mg,其中小檗堿的含量為18.01mg/片,符合規(guī)定。根據含量測定的結果換算給藥劑量。5.3生物酶活性成分血藥濃度測定方法藥動學主要研究體內血漿中藥物濃度變化規(guī)律和尿液中的排泄特征,因此分別建立雙花百合片主要活性成分血藥濃度測定方法和尿藥濃度測定方法,具體內容詳見文獻報道5.4雙花百合成像組人體藥代動力學研究5.4.1倫理批準批準試驗要嚴格遵守赫爾辛基宣言,臨床試驗方案由中國醫(yī)學科學院皮膚病研究所倫理委員會審核批準;研究者在受試者開始試驗前將試驗的相關信息充分告知受試者,受試者于試驗前均自愿簽署知情同意書。5.4.2分組、給藥方案按照圖12方案給藥,試驗藥物:雙花百合片(國藥準字Z20123033),規(guī)格:0.6g/片,服藥方式:空腹口服,單次給藥一次4片,多次給藥一天3次每次4片,健康受試者:12名,男女各半。5.4.3采集血液的測定單次給藥時分別在給藥前(0h)及給藥后0.25,0.5,0.75,1,1.33,1.67,2,2.5,3,4,5,6,8,12,24,48,72和96h采集血液;多次給藥時,連續(xù)給藥5天,于第12,13,14天早晨給藥前采集靜脈血以測定谷濃度,第14天采血時間同單次給藥。尿液收集時間分別在單次給藥前(0h)及給藥0-2,2-4,4-8,8-12,12-24,24-36,36-48,48-60,60-72h后分段采集。5.4.4藥代動力學參數12名健康受試者單、多次給藥后9種生物堿的平均血藥濃度-時間曲線見圖13和圖14;12名受試者單次(多次)口服雙花百合片后9種生物堿類成分的主要藥代動力學參數見表2,表3;男、女受試者分別單次口服雙花百合片后9種生物堿的主要藥動學參數比較見表4;12名健康受試者單、多次給藥后綠原酸(A)和?；悄懰?B)的平均血藥濃度-時間曲線比較圖見圖15;雙花百合片給藥后綠原酸在人體內的藥代動力學參數見表5;男、女受試者分別單次口服雙花百合片后綠原酸的主要藥動學參數比較見表6;受試者單次口服雙花百合片后尿液中九種生物堿和綠原酸的累積排泄量和累積排泄率見表7。5.4.5?；悄懰嵩谘獫{中的代謝特征受試者單次給藥后,大多成分在體內吸收快,血藥濃度達峰時間為1.0-2.7h,t為提高藥物的安全性和有效性,藥動學特征是新藥設計需考慮的關鍵特性之一。藥動學研究可以為闡明和解釋臨床用藥之間發(fā)生的復雜的相互作用提供幫助。本研究中發(fā)現,紫堇靈的主要藥動學參數(C此外,與文獻牛磺膽酸