藥物的抗病毒實驗

二、內(nèi)容（一）原理病毒是一類結(jié)構(gòu)簡單、非細胞形態(tài)專性細胞內(nèi)寄生微生物，必須在易感活動物、雞胚或細胞內(nèi)才能進行復制增殖。所以可用動物、雞胚或細胞來進行病毒培養(yǎng)和藥品抗病毒試驗?？山?jīng)過觀察細胞培養(yǎng)液酸堿度改變、病毒致細胞病變效應(yīng)（CPE）、病毒滴度（PFU）改變、病毒基因組mRNA水平改變、雞胚尿囊液或動物血清等對應(yīng)指標改變，來判斷藥品抗病毒試驗效果。藥物的抗病毒實驗第1頁（二）材料1.9~10d日齡雞胚，殼白凈且厚薄均勻雞卵（萊亨雞受精卵因為卵殼薄，在孵育過程中便于檢驗，為首選）2.Hep-2細胞或MDCK細胞3.病毒：如IFV（FM1株）、RSV（Long株）4.藥品：試驗藥品，陽性對照藥5.動物：小鼠等（三）操作方法藥物的抗病毒實驗第2頁 雞胚培養(yǎng)為慣用病毒培養(yǎng)法之一，當前主要用于痘類病毒、粘病毒、皰疹病毒分離、判定、制備抗原和疫苗生產(chǎn)等。1.接種方法 病毒雞胚培養(yǎng)法主要有四種接種路徑，即尿囊腔、絨毛尿囊膜、羊膜腔和卵黃囊，不一樣病毒應(yīng)選擇各自適宜接種路徑，并依據(jù)接種路徑確定雞胚孵育日齡（見表）。下面將以流感病毒為例進行說明。一）雞胚法藥物的抗病毒實驗第3頁

表6-1

雞胚孵育日齡及接種路徑選擇接種病毒名稱接種部位雞胚日齡收獲材料痘類病毒、單純皰疹病毒絨毛尿囊膜9-10絨毛尿囊膜流感病毒、腮腺炎病毒尿囊腔9-11尿囊液流感病毒首次分離羊膜腔12-14羊水一些嗜神經(jīng)性病毒卵黃囊5-6卵黃液藥物的抗病毒實驗第4頁2.IFV-FM150%雞胚感染量（EID50）測定用生理鹽水將病毒作10倍系列稀釋，分別接種雞胚，0.1ml/胚，同時設(shè)正常對照，共6組，每組5胚。35℃孵育72h，置4℃冰箱過夜，搜集尿囊液做血凝試驗，按Reed-Muench法計算FM1EID50。藥物的抗病毒實驗第5頁3.藥品對雞胚毒性作用選用健康9~11日齡雞胚，消毒備用。將受試藥和對照藥作10倍系列稀釋5~6個濃度，如100mg/ml、10mg/ml、1mg/ml、100μg/ml、10μg/ml，每個濃度接種5胚，0.25ml/胚。35℃培養(yǎng)5d后觀察結(jié)果（死亡/存活）。確定兩種藥品對雞胚最大無毒劑量（TC0），用于正式試驗。藥物的抗病毒實驗第6頁4.藥品對FM1抑制作用雞胚隨機分為14組，每組5胚，即試驗藥六個劑量組（從TC0開始作10倍系列稀釋）、陽性對照藥六個劑量組（同前）、生理鹽水和病毒對照組。將不一樣濃度藥液注入雞胚中，0.25ml/胚，30min后經(jīng)相同路徑注入100EID50病毒0.1ml，對照組以生理鹽水代替。35℃溫箱孵育5d。收獲尿囊液，測其血凝效價，以能抑制32倍以上所注射最小藥品量，即為其最小抑制劑量（MIC）。藥物的抗病毒實驗第7頁4.1雞胚接種（1）孵育9~10d左右雞胚，在照蛋燈下用蠟筆標出氣室和胎位。（2）雞胚直立于固定架上，氣室端向上，按常規(guī)以碘酒，酒精消毒。（3）用磨蛋器在氣室中央磨一小孔，再用碘酒擦拭。（4）用lml注射器吸收病毒懸液，針頭從氣室小孔刺入，沿胚胎長軸刺入0.5~1.0cm深度；此時針頭已在尿囊腔中，注入0.2ml病毒懸液。（5）拔出針頭，用鑷子將膠布沾酒精燒灼后將小孔封閉，置于35~36℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)二天，天天翻動兩次，用照蛋燈檢視一次。培養(yǎng)二天后。置-20℃冰箱2h后，無菌操作收獲尿囊液。藥物的抗病毒實驗第8頁4.2尿囊液收獲（1）從冰箱中取出雞胚，用碘酒，酒精消毒氣室部位。（2）用無菌鑷子除去膠布并去除氣室部分卵殼。（3）用無菌毛細吸管插入尿囊腔中輕輕吸收尿囊液（防止血管破裂），置于無菌試管中。（4）取得尿囊液取一部分做血凝和血凝抑制試驗（定性），判斷病毒增殖情況并對病毒進行判定；同時做無菌試驗。藥物的抗病毒實驗第9頁4.3血凝和血凝抑制試驗（1）血凝試驗 血凝試驗詳細操作方法，參考本教材第四章第四節(jié)內(nèi)容：病毒分離培養(yǎng)判定和血清學檢測。[結(jié)果判斷]以“+”號多少表示血凝程度：++++100％RBC發(fā)生血凝，形成花邊拉網(wǎng)狀，紅細胞呈薄層均勻鋪于板孔底，呈細沙狀或薄膜狀；+++75％RBC發(fā)生血凝，紅細胞雖鋪于孔底，呈細沙狀，但邊緣不整有下沉趨勢；++50％RBC發(fā)生血凝，紅細胞在孔底呈一環(huán)狀，四面有小凝集塊；+25％RBC發(fā)生血凝，紅細胞在孔底沉聚呈小圓點，邊緣不光滑，周圍有小凝集塊；-100％RBC沉積，紅細胞于孔底呈一小圓點，邊緣光滑整齊，無凝集現(xiàn)象。 以使50％RBC發(fā)生凝集最高稀釋倍數(shù)，為病毒血凝效價。計算藥品MIC。藥物的抗病毒實驗第10頁（2）病毒血凝抑制試驗 依據(jù)血凝試驗滴定病毒血凝效價，以“2＋”凝集者含有1個病毒血凝單位。如流感病毒血凝效價為1:160，即病毒液稀釋至1:160時，每0.25ml中含1個血凝單位，若要將0.25ml病毒液配制成含4個血凝單位時，應(yīng)稀釋成1:（160÷4），即1:40稀釋。在做血凝抑制試驗時用4個血凝單位。將病毒液配成4個血凝單位。血凝抑制試驗方法，參考本教材第四章第四節(jié)內(nèi)容：病毒分離培養(yǎng)判定和血清學檢測。藥物的抗病毒實驗第11頁主要依據(jù)細胞對病毒敏感性選擇適宜細胞株。人類病毒用人或猴組織較敏感，所以，研究人病毒性疾病慣用人胚腎、人胚肺或人羊膜細胞。組織培養(yǎng)方法中以單層細胞培養(yǎng)是最慣用方法，它又有原代和次代細胞培養(yǎng)、二倍體細胞株和傳代細胞系三種類型。本試驗僅介紹對傳代細胞操作方法。二）細胞培養(yǎng)法藥物的抗病毒實驗第12頁1.病毒TCID50滴定（1）原理多數(shù)病毒感染體外培養(yǎng)細胞后，常引發(fā)細胞形態(tài)學改變，如細胞團縮、裂解和細胞腫大等，這種改變稱為病毒致病變效應(yīng)（cytopathiceffect，CPE），能夠直接經(jīng)過顯微鏡觀察，亦可經(jīng)過染色得以識別和判斷。CPE程度可間接反應(yīng)病毒毒力，所以利用這種特征能夠用來測定病毒毒力。即能在半數(shù)細胞培養(yǎng)板孔或試管內(nèi)引發(fā)細胞發(fā)生病變所需病毒量，定義為病毒50％組織細胞感染指數(shù)（50％tissuecultureinfectiousdose，TCID50）。在從事藥品抗病毒試驗中，慣用100TCID50病毒感染量進行。藥物的抗病毒實驗第13頁測定時，首先在微量細胞板上培養(yǎng)敏感細胞，待細胞貼壁形成單層，棄上清。將待測病毒用維持液做連續(xù)10倍系列稀釋后加入細胞單層，逐日觀察，直至病毒產(chǎn)生CPE不再進展為止。詳細時間依據(jù)病毒增殖特點而定，如腸道病毒增殖快速，普通48h即可；RSV、VSV增殖也較快，所以48~72h也能夠觀察、染色、計算。藥物的抗病毒實驗第14頁（2）試驗材料 細胞：MDCK細胞或Hep-2細胞，或其它敏感細胞。 病毒：流感病毒（IFV）或呼吸道合胞病毒（RSV）。 試劑：DMEM細胞培養(yǎng)基，新生小牛血清，胰蛋白酶或VTP消化液，PBS，青霉素100U/ml、鏈霉素100U/ml，MTT(4,5-二甲基噻唑-2,5-二苯基四唑溴化物)，結(jié)晶紫染液等。 材料：細胞培養(yǎng)板（1塊/組），tip頭（2盒/排），微量移液器，5ml或10ml吸管（2支/組），青霉素瓶帶塞（10個/組），酒精缸，鑷子（2個/組），1ml注射器，毛細吸管等。藥物的抗病毒實驗第15頁（3）操作步驟1）制備細胞①將細胞生長面朝上，輕輕倒掉瓶中培養(yǎng)液，用PBS小心洗滌2次，注意吸管尖頭不要伸到細胞瓶中。②用上述吸管吸收1mlVTP加入細胞瓶中，鋪滿整個細胞生長面即可；室溫或手握住消化，約3～5min。當細胞胞質(zhì)回縮、細胞間隙增大呈拉網(wǎng)狀后，即可停頓消化，盡可能棄盡消化液，繼續(xù)利用殘余消化液消化，直至細胞大部分易在外力作用下從細胞瓶表面脫落下來為止。藥物的抗病毒實驗第16頁③加入適量營養(yǎng)液到細胞瓶中，用小頭吸管吹打瓶壁細胞以及脫落細胞充分使細胞均勻，吹打時動作要輕柔不要用力過猛，盡可能不要出現(xiàn)泡沫。吸一滴細胞懸液于Ep管中。④計數(shù)：用吸管吹打細胞懸液，取少許細胞懸液與等量0.04％臺盼蘭混勻，在計數(shù)板上蓋玻片一側(cè)加該細胞懸液，加樣量不要溢出蓋玻片，也不要過少或帶氣泡。當細胞密度為106/ml時即可。 一瓶細胞消化后加入適量營養(yǎng)液制成所需細胞懸液，濃度約為1×106/ml。用微量移液器將細胞懸液加入40孔板微孔中，每孔100μl，37℃、5%CO2孵育箱培養(yǎng)24h，形成單層后，做病毒滴定用。藥物的抗病毒實驗第17頁2）50%組織細胞感染量（TCID50）測定①稀釋病毒液：取無菌青霉素瓶9支，各管分別加3%小牛血清維持液2.7ml，然后向第一管加IFV病毒液0.3ml，重復吹吸混合三次，從第一管內(nèi)吸液0.3ml加入第二管內(nèi)，重復混合三次，從第二管內(nèi)吸液0.3ml加入第三管內(nèi)，重復混合三次，依這類推將待測病毒液做連續(xù)10倍稀釋，使病毒稀釋為10-1，10-2，10-3…10-9。藥物的抗病毒實驗第18頁②病毒接種：將長好單層細胞培養(yǎng)板各孔細胞液全部傾棄，用微量移液器把各稀釋度IFV病毒從低濃度開始依次加入各微孔中，每稀釋度平行加2孔，每孔100μl。細胞對照孔不加病毒液，只加維持液。置37℃、5%CO2孵育箱中孵育。③結(jié)果觀察：于孵育后18、24、36、48、72h在倒置顯微鏡下觀察CPE，病毒可引發(fā)細胞圓縮、堆聚及脫落等現(xiàn)象?！?”表示細胞正常；“+”表示有25%細胞產(chǎn)生病變、圓縮、破碎脫落；“2+”有50%細胞產(chǎn)生病變；“3+”有75%細胞產(chǎn)生病變；“4+”有75%以上細胞產(chǎn)生病變（試驗時，有觀察24h~48h即可染色計算；或逐日觀察CPE，直至病毒產(chǎn)生CPE不再進展為止）。藥物的抗病毒實驗第19頁3）按Reed-Muench法計算TCID50，參見下表：10-38/810010/1010010-42/8262/82510-50/80140/14010-60/80220/22010-70/80300/30010-80/80380/380累積數(shù)（孔）病變細胞孔病毒稀釋度病變孔數(shù)/接種孔數(shù)有病變↑無病變↓百分比百分比%藥物的抗病毒實驗第20頁

按表中可見，10-3稀釋病變高于50%；10-4稀釋病變低于50%；50%病變分布于10-3與10-4之間，計算公式以下：

高于50%病變率-（50%）距離百分比=-高于50%病變率-低于50%病變率×lg稀釋倍數(shù)

100-50

=-100-25×lg10=-0.67 lgTCID50=高于50%病變低稀釋度對數(shù)+距離比=-3+(-0.67)=-3.67即1個TCID50=10-3.67，查0.67反對數(shù)為4.68，即病毒做4.68×103倍稀釋時取0.1ml接種細胞，可使50%細胞產(chǎn)生病變。藥物的抗病毒實驗第21頁 附錄：怎樣計算200個TCID50？ 4.68×103÷200=23.4，將病毒作23.4倍稀釋時即得200個TCID50。按計算結(jié)果，用100個TCID50病毒進行藥品體外抗病毒試驗。藥物的抗病毒實驗第22頁2.病毒增殖及病毒感染單位量測定2.1病毒增殖 將凍存病毒株復蘇后接種于敏感細胞進行增殖，2~3d后出現(xiàn)經(jīng)典細胞病變，待病變達80~90％時收獲病毒。重復凍融3次并低速離心取上清，分裝后用空斑形成單位試驗（plaqueformingunit,PFU）測定病毒感染量，保留于-80℃?zhèn)溆?。在進行藥品抗病毒試驗中，亦可用該試驗測定藥品對病毒增殖影響，而且結(jié)果可能更準確、可靠。藥物的抗病毒實驗第23頁2.2病毒感染單位量測定 用PFU表示。以5.0×105/ml密度接種敏感細胞于6孔細胞板中。置37℃、5％CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使其24h內(nèi)長成單層；在冰盤上操作，用維持液將病毒作10倍連續(xù)系列稀釋（10-1～10-8）（操作以下列圖所表示）；藥物的抗病毒實驗第24頁注：即在一系列2mlEp管中先加入1.8ml維持液，取

0.2ml

病毒加入第一只Ep管中，充分混勻后病毒稀釋度為10-1，取混合后0.2ml

病毒懸液加入第二只Ep管中作為稀釋度10-2，依這類推作系列稀釋，則得到連續(xù)10倍稀釋病毒懸液。藥物的抗病毒實驗第25頁棄去細胞培養(yǎng)板中各孔中營養(yǎng)液，每孔接種對應(yīng)稀釋度病毒懸液0.5ml，每個稀釋度重復3孔。37℃吸附2h，每15min搖動數(shù)下以確保病毒吸附分布均勻；棄去各孔中病毒液，PBS輕輕洗滌一次。每孔加入2ml覆蓋層（含6％新生牛血清DMEM與1.5％瓊脂糖等體積混勻，配好后馬上使用，以免凝固），水平放置15min使其凝固；藥物的抗病毒實驗第26頁

33℃，5％CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d。剔除覆蓋層，每孔加入1ml0.5％結(jié)晶紫染色10min，自來水沖洗后選擇空斑數(shù)清楚且易于分辨稀釋度計數(shù)空斑，依據(jù)空斑數(shù)計算病毒PFU。下列圖顯示是RSV空斑形成試驗結(jié)果。PFU計算方法：a·b

PFU＝v（PFU：空斑形成形成單位/ml；a：空斑均數(shù)；b：病毒稀釋度倒數(shù)；v：病毒量/ml）藥物的抗病毒實驗第27頁

1：正常對照；2～6：病毒稀釋度分別為

10－4，10－5，10－6，10－7，10－8

病毒空斑形成試驗結(jié)果示意圖

3

2

1654藥物的抗病毒實驗第28頁2.藥品對細胞毒性測定 已長成單層細胞（96孔板），傾去培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，加入用無血清1640作連續(xù)10倍系列稀釋受試藥品，100μl/孔，每個濃度重復4孔，并設(shè)正常細胞對照。整個試驗重復3次。37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)3d，觀察細胞病變效應(yīng)（CPE），按Reed-Muench法計算藥品半數(shù)中毒濃度（TD50）和最大無毒濃度（TD0）。陽性對照藥毒性測定，與受試藥品同法同時在同一板中進行。藥物的抗病毒實驗第29頁4.藥品抗病毒試驗4.1微量細胞病變抑制法 已長成單層細胞（96孔板），傾去培養(yǎng)液，用PBS洗2次，加入100TCID50病毒，100μl/孔，37℃5%CO2下吸附2h，使病毒進入細胞內(nèi)。棄病毒液，用DMEM液洗2次，洗去游離病毒。加入受試藥TD0濃度作連續(xù)2倍系列稀釋6個濃度，每個濃度均重復3孔，并分別設(shè)置細胞對照、病毒對照和空白對照孔，陽性對照藥同上。37℃、5%CO2下培養(yǎng)3d，統(tǒng)計CPE，按Reed-Muench法計算能抑制50%CPE產(chǎn)生藥品有效濃度（EC50）。整個試驗重復3次。藥物的抗病毒實驗第30頁4.2中性紅染色法

基本步驟同上，加入藥品培養(yǎng)3d后待CPE不再進展時，棄維持液，用PBS洗2次，每孔加入0.2ml中性紅染液（0.04%），避光，37℃、5%CO2孵育1.5h。棄染色液，用PBS洗2次，控干，每孔加入0.2ml90%乙醇（無水乙醇：0.2M，pH4.2枸櫞酸緩沖液=9：1），室溫放置2~3h，搖勻，以空白對照孔調(diào)零，在酶標儀546nm處比色，測定其吸光度A值。依據(jù)各組平均A值，計算藥品抑制百分率，再按Reed-Muench法計算50%抑制濃度（IC50）等各項結(jié)果。整個試驗重復3次。

試驗組平均A值-病毒對照組平均A值抑制百分率=細胞對照組平均A值-病毒對照組平均A值×100%藥物的抗病毒實驗第31頁4.3MTT法 基本步驟同上，當病毒對照組細胞CPE在(+++)～(++++)時棄培養(yǎng)液上清，每孔加入含5g·LMTT培養(yǎng)液50μl，繼續(xù)培養(yǎng)2~3h后棄去MTT上清，每孔加DMSO100μl，混勻5min后，用酶標儀測570nm波優(yōu)點吸光度A值。按下述公式計算藥品對病毒抑制率：病毒抑制率(%)=(藥品處理組A均值-病毒對照組A均值)/(細胞對照組A均值-病毒對照組A均值)×100%，結(jié)合細胞毒性試驗結(jié)果，用統(tǒng)計軟件SPSS13.0Probit回歸法，或按Reed-Muench法，計算受試藥半數(shù)中毒濃度TD50和半數(shù)有效濃度EC50，并計算藥品治療指數(shù)（TI）。藥物的抗病毒實驗第32頁4.4空斑抑制法 參考上述方法進行（略），與病毒對照組比較，計算藥品50%抑制濃度IC50。4.4藥品對RSV侵入細胞阻斷作用 依據(jù)藥品毒性試驗結(jié)果，從藥品最大無毒濃度開始，將不一樣濃度受試藥100μl預先處理細胞2h,以PBS洗滌2次后用100TCID50病毒每孔100μl攻擊,吸附2h，每隔15min搖擺1次，使病毒均勻吸附。棄病毒液,加100μl細胞維持液，置37℃、5%CO2培養(yǎng)，每日觀察并統(tǒng)計CPE。試驗設(shè)正常細胞對照組、病毒對照組、陽性對照組和藥品組。當病毒對照組CPE在75%~100%時棄培養(yǎng)液上清，每孔加入含5g·LMTT培養(yǎng)液50μl，繼續(xù)培養(yǎng)2～3h后棄去MTT上清，每孔加100μlDMSO，混勻5min后，用酶標儀測490nm波優(yōu)點A值。按Reed-Muench法計算藥品半數(shù)中毒濃度TD50和半數(shù)有效濃度EC50。藥物的抗病毒實驗第33頁4.5藥品對RSV直接殺傷作用 依據(jù)藥品毒性試驗結(jié)果，從藥品最大無毒濃度開始，將不一樣濃度含藥維持液與100μl100TCID50病毒等體積混合，37℃、5%CO2條件下作用2h后，再將其感染Hep-2細胞，100μl/孔，吸附2h后用PBS洗滌2次，每日觀察并統(tǒng)計細胞病變效應(yīng)（CPE）。試驗設(shè)正常細胞對照組、病毒對照組、陽性對照組和藥品組。當病毒對照組細胞CPE在75%~100%時棄培養(yǎng)液上清，每孔加入含5g·LMTT培養(yǎng)液50μl，繼續(xù)培養(yǎng)2~3h后棄去MTT上清，每孔加DMSO100μl，混勻5min后，用酶標儀測490nm波優(yōu)點A值。按Reed-Muench法計算藥品半數(shù)中毒濃度TD50和半數(shù)有效濃度EC50。5.治療指數(shù)（TI） 按TI=TD50/EC50或TD50/IC50進行計算。藥理學試驗要求，TI﹥4表示藥品有效。藥物的抗病毒實驗第34頁三）體內(nèi)抗病毒試驗1.試驗動物選擇

試驗動物在病毒學研究中用途主要有：分離與判定病毒、制備疫苗及診療抗原、制備免疫血清、研究病毒致病性、免疫性、發(fā)病機理及有效藥品療法等。病毒接種于何種動物以及選擇何種接種路徑，主要取決于病毒種類和試驗研究目標。應(yīng)依據(jù)試驗需要選擇最敏感動物作為試驗對象，慣用動物有小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、乳鼠和猴子等，接種時要依據(jù)病毒對動物及組織細胞親嗜性而選擇特定部位，慣用接種路徑有鼻腔、腹腔、腦內(nèi)、皮下、肌肉、靜脈及小鼠經(jīng)口接種、家兔角膜注射等。給藥方式亦可有腹腔、灌胃、靜脈注射、肌肉注射、吸入等。藥物的抗病毒實驗第35頁采集全血、血漿、血清、組織臟器或細胞等標本，進行對應(yīng)指標檢測。為降低個體差異，普通試驗選擇成年動物，動物體重盡可能一致；如無特殊要求，試驗動物性別應(yīng)先選雄性動物或雌雄各半，且動物要健康，雌性動物懷孕及授哺期不宜采取。另外，依據(jù)試驗研究不一樣準確程度要求，選擇標準化試驗動物。標準化試驗動物是指按遺傳控制方法和微生物控制標準培育而成動物。按遺傳學控制原理可分為近交系、遠交系、突變系、雜交一代等，按微生物學控制原理可分為無菌動物、悉生動物、無特定病原體動物、清潔動物等。病毒接種完成后，按一定級別動物喂養(yǎng)標準喂