哈茨木霉h33g蛋白基因ha09974功能研究

哈茨木霉h33g蛋白基因ha09974功能研究

反相互作用因子（transport，tf）也被稱為反相互作用因子，直接或間接地與基因啟動子區(qū)域的環(huán)境作用元素相互作用，并對初始基因轉(zhuǎn)移過程進(jìn)行監(jiān)督管理。木霉菌是自然界廣泛存在的絲狀真菌,一些木霉菌生長快速、產(chǎn)孢量大、能產(chǎn)生抗生物質(zhì)或誘導(dǎo)植物抗病性,對植物病原菌有較強(qiáng)的拮抗能力,因此作為植物病害生防真菌被廣泛應(yīng)用1材料和方法1.1質(zhì)粒及試劑哈茨木霉Th33、番茄灰霉病菌BotrytiscinereaPers.、黃瓜枯萎病菌Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum、質(zhì)粒pCSN44(具有潮霉素B抗性基因)、根癌農(nóng)桿菌EHA105為本實(shí)驗(yàn)室保存;質(zhì)粒pDHt/SK由美國國立衛(wèi)生研究院惠贈;質(zhì)粒pAN7-1和pKH-KO-G418分別由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所土傳病害研究組和細(xì)菌病害研究組保存。質(zhì)粒pEASY-T1及E.coliTrans5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。真菌DNA小量提取試劑盒E.Z.N.A.?FungalDNAKit(OMEGA)購自江晨生物技術(shù)有限公司;小型質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、FastQuantRTKit(withgDNase)、總RNA提取試劑盒TranZolUpRNA購自北京天根生化公司;DNA連接試劑盒ClontechIn–FusionHDCloningKit購自北京六合通經(jīng)貿(mào)有限公司;其他試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。引物合成與測序由北京華大基因公司合成有限公司完成,引物設(shè)計通過Primerpremier5軟件完成,引物序列見表1。1.2基因克隆與tha09974序列分析參考Th33全基因組序列(GenBank:PRJNA272949)1.3潮霉素b抗性基因敲除采用同源雙交換技術(shù),構(gòu)建Tha09974敲除突變株(圖1)。利用引物1F/1R和2F/2R(表1),以Th33基因組DNA為模板擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄因子Tha09974基因上、下游同源臂序列。以H1F/H1R為引物,以質(zhì)粒pCSN44作為模板,擴(kuò)增潮霉素B抗性基因。運(yùn)用2次重疊延伸PCR(splicingoverlapextensionPCR,SOE-PCR)擴(kuò)增,首先利用引物H1F/2R將潮霉素B抗性基因與Tha09974基因的下游同源臂連接,然后利用引物1F/2R,將上述連接產(chǎn)物與上游同源臂片段相連,獲得Tha09974基因敲除盒。分別對敲除盒和質(zhì)粒pDHt/SK進(jìn)行SpeI/HindIII雙酶切,酶切產(chǎn)物用T4DNALigase連接,獲得Tha09974基因敲除載體pDHt/SK-H?9974。在大腸桿菌EscherichiacoliTrans5α中復(fù)制和保存。采用根癌農(nóng)桿菌AgrobacteriumtumefaciensEHA105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法(ATMT方法)1.4pcr擴(kuò)增及基因表達(dá)載體構(gòu)建以哈茨木霉Th33基因組DNA作為模板,以R9974F/R9974R為引物(表1)PCR擴(kuò)增Tha09974基因片段。以質(zhì)粒pAN7-1作為模板,以PF/PR為引物PCR擴(kuò)增PgpdA啟動子片段,以TF/TR為引物PCR擴(kuò)增TtrpC終止子片段(表1)。將Tha09974、PgpdA啟動子、TtrpC終止子片段按1:1:1的摩爾濃度比混合,采用重疊延伸PCR方法將3個片段進(jìn)行連接。第一步:94℃5min;95℃55s,50℃45s,72℃50s,15個循環(huán);將啟動子片段、Tha09974基因片段、TtrpC終止子片段順次拼接。取第一步所得PCR產(chǎn)物2μL,以PF/TR為引物進(jìn)行第二步PCR擴(kuò)增,PCR過程為94℃4min;95℃55s,63.5℃45s,72℃2min,30個循環(huán);72℃5min;4℃10min。第二輪PCR產(chǎn)物經(jīng)測序并驗(yàn)證,獲得Tha09974基因表達(dá)盒。將真菌表達(dá)載體pKH-KO-G418采用SpeⅠ/NotⅠ雙酶切,酶切產(chǎn)物與Tha09974基因表達(dá)盒片段按摩爾比為1:2混合,用ClontechIn-FusionHDCloningKit進(jìn)行連接。獲得Tha09974基因表達(dá)載體pKH-KO-G9974(圖1)。采用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法1.5菌落培養(yǎng)和生物量測定分別將哈茨木霉野生型Th33、突變株?9974和回復(fù)突變株R9974接種在PDA平板上活化,培養(yǎng)4d后,用直徑0.5cm的打孔器,分別打取菌餅接種于新的PDA平板中央,28℃下培養(yǎng)。分別于16、28、40和52h后測定菌落半徑。為測定菌株生物量,將Th33、?9974、R9974菌株用直徑0.5cm打孔器分別打取菌餅10個,接種在PD培養(yǎng)基中,28℃、200r/min培養(yǎng)2d后用濾紙過濾獲得菌絲,將菌絲置于65℃烘箱中烘24h,稱量生物量。上述試驗(yàn)均重復(fù)3次1.6制備成汁率及最佳菌種數(shù)將活化后的Th33野生菌、突變株?9974、回復(fù)突變株R9974分別接種到PDA平板上,28℃培養(yǎng)5d,分別打取50塊菌餅,加入20mL滅菌蒸餾水,渦旋混合震蕩2min,雙層1000目尼龍網(wǎng)布過濾,獲得孢子懸液,用血球計數(shù)板計孢子數(shù)。試驗(yàn)重復(fù)3次1.7木霉菌對致病性真菌的抗逆性采用平板對峙培養(yǎng),檢測木霉菌及其突變株對病原菌的抑制作用2結(jié)果與分析2.1ch2型轉(zhuǎn)錄因子Tha09974基因全長1195bp,含有1個內(nèi)含子,開放閱讀框1134bp,編碼377個氨基酸,含有2個保守的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域。Tha09974氨基酸序列與其他具有同源性序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)顯示,該序列與木霉菌新種貴州種T.guizhouense的C2H2型轉(zhuǎn)錄因子(OPB45677.1)相似度達(dá)到97%;與其他真菌來源的C2H2型轉(zhuǎn)錄因子BrlA及opl(old-paired-like)存在不同程度的相似性,如與來自淡紫擬青霉PurpureocilliumlilacinumXP＿018177548.1、層生鐮刀菌F.proliferatumCZR35546.1和麥角菌ClavicepspurpureaCCE32673.1的opl蛋白序列的相似性分別為57%、49%和51%;與來自白僵菌BeauveriabassianaKGQ06299.1、枝頂孢屬A.chrysogenumA0A0A7HJC7.1、鐮刀菌F.culmorumPTD11466.1和米曲霉A.oryzaeQ2UQZ5.1BrlA的相似性分別為56%、52%、54%和33%(圖2)。因此確定Tha09974編碼一種C2H2型轉(zhuǎn)錄因子。2.2回復(fù)突變株的獲得構(gòu)建Tha09974基因敲除載體pDHt/SK-H?9974,采用ATMT方法轉(zhuǎn)入哈茨木霉Th33,獲得Tha09974基因敲除突變株,構(gòu)建回復(fù)突變載體pKH-KO-G9974,采用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入?9974原生質(zhì)體,獲得Tha09974回復(fù)突變株。采用PCR技術(shù)驗(yàn)證上述突變株,結(jié)果顯示,野生菌Th33中僅存在Tha09974片段(分別為1195和1134bp),不存在潮霉素抗性基因和G418基因,?9974中不存在Tha09974片段但存在潮霉素抗性基因片段(1221bp),R9974中存在Tha09974、潮霉素抗性基因和G418抗性基因片段(873bp)(圖3),說明突變株?9974和R9974是正確的。2.3高效木霉菌生長觀察在PDA培養(yǎng)基上生長的Th33、?9974、R9974的菌落形態(tài),與Th33和?9974相比,R9974的菌落顏色較淺,產(chǎn)孢量顯著低于Th33和R9974(圖4A)。此外,?9974在28h內(nèi)的生長速度明顯慢于Th33和R9974。但28h后的生長速度與Th33和R9974差異不明顯(圖4B),推測Tha09974不影響木霉菌的生長,但可能影響菌株對環(huán)境的適應(yīng)性。PD培養(yǎng)條件下,?9974的生物量顯著少于R9974與Th33野生菌,比R9974少53%,比Th33野生菌少50%(圖4C)。說明Tha09974正調(diào)控菌株生物量的形成。2.4th33野生菌及突變株的產(chǎn)孢量測定Th33野生菌及突變株?9974、R9974的產(chǎn)孢量結(jié)果表明,Th33野生菌及突變株R9974、?9974的產(chǎn)孢量分別為(1.25±0.52)×102.5th33與國家火毒菌株的競爭野生型Th33及其突變株?9974、R9974分別與黃瓜枯萎病菌、番茄灰霉病菌進(jìn)行對峙培養(yǎng)。對峙培養(yǎng)第2～3d,木霉菌和病原菌開始接觸,野生型Th33和R9974的菌絲能夠繼續(xù)在病菌菌落表面生長,7～8d后開始產(chǎn)孢,病菌生長受到明顯抑制。相比于野生型Th33和R9974,突變株Δ9974的競爭性明顯減弱。?9974菌絲相對較少,與病菌菌落交界處出現(xiàn)拮抗帶,其中?9974與黃瓜枯萎病菌對峙培養(yǎng)時的拮抗帶較寬,而與番茄灰霉病菌交界處的拮抗帶較窄,并且?9974的菌絲不能在病菌表面延伸生長(圖5A和5B)。野生菌Th33對番茄灰霉病菌和黃瓜枯萎病菌的生長抑制率分別為(58.47±2.2)%和(69.46±1.16)%,突變株?9974的相應(yīng)抑制率分別為(34.11±6.76)%和(38.10±5.14)%。R9974對番茄灰霉病菌的抑制率與野生菌差異不明顯,但對黃瓜枯萎病菌的抑制率低于野生菌Th33,為(63.2±1.39)%(圖5C)。綜上可知,Tha09974敲除后,顯著降低了菌絲的重寄生能力和對病原菌的拮抗能力。3不同轉(zhuǎn)錄因子對碳源基因轉(zhuǎn)錄的影響真菌中C2H2型轉(zhuǎn)錄因子的功能,已