獸用基因工程生物制品的安全性

獸用基因工程生物制品是用微生物、微生物代謝產(chǎn)物、原蟲、血液或組織等加工制成，作為預(yù)防、治療、診療特定傳染病或其它疾病制劑。作為畜禽疾病預(yù)防控制利器，獸用生物制品在畜牧業(yè)發(fā)展中發(fā)揮著越來越主要作用，其研發(fā)和生產(chǎn)應(yīng)用促進(jìn)了畜牧業(yè)繁榮。因?yàn)槠浔旧硖卣骱桶踩芾矸矫媛┒?，在研發(fā)和應(yīng)用中也可能出現(xiàn)一些生物災(zāi)害。概括起來主要有：試驗(yàn)研究人員感染、病原微生物對環(huán)境污染、以及遺傳性狀不穩(wěn)定。獸用生物制品生物安全問題直接或間接影響人類和動物身體健康和生命安全。獸用基因工程生物制品的安全性第1頁獸用基因工程生物制品的安全性第2頁第一節(jié)

獸用基因工程生物制品概況當(dāng)前獸用基因工程生物制品，可分為基因工程亞單位疫苗、重組活載體疫苗、基因缺失疫苗、核酸疫苗、多肽疫苗和轉(zhuǎn)基因植物疫苗等幾類。1.基因工程亞單位疫苗或基因工程蛋白質(zhì)疫苗經(jīng)過基因工程將病原微生物主要免疫原基因在宿主細(xì)胞表示，再從表示產(chǎn)物制備而成。其產(chǎn)品或是病原蛋白質(zhì)(或亞單位)，或是其抗原決定簇。這類疫苗可能產(chǎn)生問題：與原始蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)差異、異源蛋白質(zhì)對宿主毒性、細(xì)菌表示系統(tǒng)對外源基因識別、T細(xì)胞對蛋白成份非敏感。對上述問題處理路徑包含：采取真核生物細(xì)胞為宿主、采取能分泌重組蛋白質(zhì)細(xì)菌為宿主、突變外源基因糖基化位點(diǎn)。獸用基因工程生物制品的安全性第3頁目標(biāo)基因獲取工程菌構(gòu)建目標(biāo)基因表示蛋白質(zhì)分離與純化產(chǎn)品獸用基因工程生物制品的安全性第4頁2.

核酸疫苗核酸疫苗是將編碼某種抗原蛋白外源基因(DNA

或RNA)直接導(dǎo)入動物體細(xì)胞內(nèi),并經(jīng)過宿主細(xì)胞表示系統(tǒng)合成抗原蛋白,誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對該抗原蛋白免疫應(yīng)答,以到達(dá)預(yù)防和治療疾病目標(biāo)。核酸疫苗優(yōu)點(diǎn)是：免疫保護(hù)力增強(qiáng)、制備簡單、同種異株交叉保護(hù)、持久免疫應(yīng)答。核酸疫苗缺點(diǎn)是：免疫原性較低、用量大、真核細(xì)胞不存在質(zhì)粒DNA主動核－質(zhì)間傳輸路徑。提升核酸疫苗免疫原性嘗試主要有：抗原基因上游插入RNA復(fù)制酶基因、在抗原基因下游插入細(xì)胞因子編碼基因、提升細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率、改變重組質(zhì)粒非編碼區(qū)。核酸疫苗通常不能在動物細(xì)胞中長久復(fù)制或不復(fù)制。獸用基因工程生物制品的安全性第5頁獸用基因工程生物制品的安全性第6頁3.

重組活載體疫苗重組活載體疫苗包含：重組DNA病毒疫苗和重組RNA病毒疫苗。重組DNA病毒疫苗是將抗原基因轉(zhuǎn)移至病毒DNA載體上而制備重組DNA疫苗。重組RNA病毒疫苗是將抗原基因轉(zhuǎn)移至病毒RNA載體上而制備重組RNA疫苗。重組活載體疫苗優(yōu)點(diǎn)主要在于：宿主體內(nèi)有識別病毒免疫系統(tǒng)、病毒能主動將其DNA或RNA傳輸至細(xì)胞內(nèi)、表示量大。重組活載體疫苗主要不足在于：對免疫力弱者可能致病、輕易出現(xiàn)非相關(guān)免疫反應(yīng)、需要避開先天或后天抗病毒免疫，等等。獸用基因工程生物制品的安全性第7頁獸用基因工程生物制品的安全性第8頁第二節(jié)

獸用基因工程生物制品安全性獸用基因工程生物制品應(yīng)用越來越廣泛，其安全性一直受到人們親密關(guān)注。對獸用基因工程生物制品安全性考慮，主要在以下幾方面：對使用動物毒性、致癌可能性、外源DNA與宿主染色體整合可能性、誘導(dǎo)產(chǎn)生抗DNA抗體可能性。對基因工程生物制品使用后擔(dān)憂主要是連續(xù)表示外源抗原可能出現(xiàn)后果：產(chǎn)生耐受性、自動免疫、過敏反應(yīng)和超敏反應(yīng)等，或最終造成機(jī)體免疫機(jī)制受抑制而易感染其它病原體?；蚬こ躺镏破钒踩栽u價(jià)應(yīng)包含：受體細(xì)胞安全性、基因操作安全性、基因重組活疫苗安全性及工業(yè)化生產(chǎn)潛在安全性。獸用基因工程生物制品的安全性第9頁一、受體細(xì)胞安全性受體細(xì)胞是用于制備基因工程生物制品表示系統(tǒng)?？煞譃樵吮硎鞠到y(tǒng)和真核表示系統(tǒng)兩大類。選擇受體細(xì)胞時(shí)應(yīng)重點(diǎn)考慮：

安全性高且不造成生物污染；

便于重組DNA導(dǎo)入；

便于篩選克隆子；

能使重組DNA分子在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定維持；

適合外源基因高效表示和表示產(chǎn)物分泌或累積；

對遺傳密碼無偏倚（沒有選擇性表示）；

遺傳性穩(wěn)定、易于擴(kuò)大培養(yǎng)或發(fā)酵；

對真核表示系統(tǒng)還要求有很好翻譯后加工機(jī)制。

獸用基因工程生物制品的安全性第10頁1.

原核生物表示系統(tǒng)原核生物表示系統(tǒng)是研究最透徹表示系統(tǒng)，慣用細(xì)菌作為受體，含有操作簡單、價(jià)格低廉、外源基因表示水平高特點(diǎn)。最為常用是大楊桿菌和枯草芽孢桿菌。大腸桿菌是腸道菌群組成部分，大部分為非致病菌，但一些血清型可引發(fā)腹瀉和敗血癥。作為外源基因受體大腸桿菌菌株遺傳背景清楚、目標(biāo)基因表示水平高、培養(yǎng)周期短、抗污染能力強(qiáng)。枯草芽孢桿菌是需氧革蘭氏陽性菌，細(xì)胞內(nèi)存在著分泌系統(tǒng)，經(jīng)常能將重組蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)基中。枯草桿菌本身沒有致病性，但其可用載體株有限，外源基因表示量也低于大腸桿菌。

獸用基因工程生物制品的安全性第11頁大腸桿菌枯草芽孢桿菌獸用基因工程生物制品的安全性第12頁2.真核表示系統(tǒng)原核表示系統(tǒng)表示量高，但目標(biāo)蛋白質(zhì)常以包涵體出現(xiàn)而致純化難，缺翻譯后加工而使表示產(chǎn)物活性較低，促使人們尋找適當(dāng)真核表示系統(tǒng)。當(dāng)前慣用真核表示系統(tǒng)有：酵母表示系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表示系統(tǒng)和哺乳動物細(xì)胞表示系統(tǒng)。酵母菌遺傳背景清楚、遺傳操作輕易，可微生物化操作，外源基因在酵母細(xì)胞中能分泌表示，但只能進(jìn)行有限翻譯后加工修飾。昆蟲細(xì)胞表示系統(tǒng)多利用桿狀病毒為外源基因載體，利用昆蟲細(xì)胞表示目標(biāo)蛋白，但分泌性較差哺乳細(xì)胞表示系統(tǒng)培養(yǎng)細(xì)胞如CHO、COH、BHK、NIH3T3為受體，以病毒或質(zhì)粒為外源基因載體。主要缺點(diǎn)是培養(yǎng)和操作難度大，且不能持久表示獸用基因工程生物制品的安全性第13頁啤酒酵母NIH3T3CHOBHK獸用基因工程生物制品的安全性第14頁

二、基因操作安全性基因操作主要包含：目標(biāo)基因獲取、載體制備、基因重組、重組子轉(zhuǎn)化與外源基因表示等步驟。1.目標(biāo)基因分子特征表示載體相關(guān)資料：目標(biāo)基因與載體圖譜，目標(biāo)基因供體、結(jié)構(gòu)功效及安全，其它元件安全統(tǒng)計(jì)。目標(biāo)基因在表示系統(tǒng)中整合情況：插入片段位點(diǎn)、邊界、拷貝數(shù)、全長DNA序列，宿主DNA序列被刪除或基因失活情況。外源插入片段表示情況：轉(zhuǎn)錄水平(RT–PCR,Northern)、翻譯水平(ELISA,Western)。獸用基因工程生物制品的安全性第15頁藍(lán)舌病毒BL3基因-pFB1表示載體獸用基因工程生物制品的安全性第16頁2

基因遺傳穩(wěn)定性基因操作遺傳穩(wěn)定性主要包括質(zhì)粒穩(wěn)定性，包含分離穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性判定時(shí)，應(yīng)從幾個(gè)方面入手：目標(biāo)基因整合穩(wěn)定性轉(zhuǎn)化體中目標(biāo)基因拷貝數(shù)、連續(xù)三代以上分離情況(Southern,PCR)。目標(biāo)基因表示穩(wěn)定性轉(zhuǎn)化體在不一樣世代中目標(biāo)基因表示情況，即轉(zhuǎn)錄、翻譯水平穩(wěn)定性，需提供不少于三代試驗(yàn)數(shù)據(jù)(Northern,

Western,

RT-PCR)。目標(biāo)性狀表示穩(wěn)定性目標(biāo)性狀在轉(zhuǎn)化體不一樣世代中表現(xiàn)，需提供不少于三代試驗(yàn)數(shù)據(jù)。重組載體安全性：能否向自然界中不含該目標(biāo)基因生物轉(zhuǎn)移。獸用基因工程生物制品的安全性第17頁三、獸用基因重組活疫苗安全性基因工程重組活疫苗是利用基因工程技術(shù)將保護(hù)性抗原基因轉(zhuǎn)移到載體（病毒、細(xì)菌）中使之表示活疫苗。依據(jù)其載體致病性有兩個(gè)制備路徑。非致病性載體攜帶異源抗原基因，產(chǎn)生新免疫。致病性載體經(jīng)過基因修飾或突變使致病性大為減弱或消失，但仍保持免疫原性?；蛑亟M活疫苗可分為：基因缺失疫苗與基因突變疫苗、復(fù)制性活載體疫苗、非復(fù)制性活載體疫苗三類。它們之間分別含有各自特點(diǎn)，在安全性方面表現(xiàn)也不盡相同。獸用基因工程生物制品的安全性第18頁1不一樣類型基因重組活疫苗基因缺失疫苗與基因突變活疫苗：屬減毒或弱毒疫苗，正常使用不引發(fā)臨床疾病，但可誘發(fā)產(chǎn)生保護(hù)性免疫力，對免疫力弱人可能致病。復(fù)制性活載體疫苗：在接種動物體內(nèi)特定免疫基因可隨載體生物復(fù)制和適量表示，產(chǎn)生抗體。非復(fù)制性活載體疫苗：不能在動物體內(nèi)復(fù)制，但特定免疫基因可少許表示而引發(fā)免疫反應(yīng)?；钶d體疫苗優(yōu)點(diǎn)：可同時(shí)開啟細(xì)胞免疫和體液免疫、可構(gòu)建多價(jià)疫苗、用量少且連續(xù)時(shí)間長、不影響相關(guān)疾病監(jiān)測和流行病學(xué)調(diào)查。活載體疫苗缺點(diǎn)：與野生載體生物發(fā)生基因重組可能性、進(jìn)化成新毒株可能性、二次免疫排斥反應(yīng)、殘余毒力問題。獸用基因工程生物制品的安全性第19頁2獸用基因工程活疫苗安全性問題對人和動物健康危害：致病性（包含毒性、致癌、致畸、致突變、致過敏等），抗藥性即轉(zhuǎn)基因微生物抗藥性，食品安全性即接種疫苗后動物性食品是否食用安全問題。對生態(tài)環(huán)境潛在危害

致病性和毒性：與供體微生物和受體微生物相比

其致病性和毒性是否增加。

生存競爭力：與非轉(zhuǎn)基因微生物相比是否增強(qiáng)。

傳輸擴(kuò)散能力：經(jīng)過水、土、氣、動植物等遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移能力

遺傳變異能力：遺傳穩(wěn)定性與適應(yīng)性變異、突變率

遺傳轉(zhuǎn)移能力：向非轉(zhuǎn)基因微生物發(fā)生遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移獸用基因工程生物制品的安全性第20頁四、獸用DNA疫苗安全性DNA疫苗是將免疫應(yīng)答目標(biāo)基因插入質(zhì)粒載體而制備生物制劑。將其導(dǎo)入動物體后經(jīng)過宿主細(xì)胞表示系統(tǒng)表示抗原，進(jìn)而誘生保護(hù)性免疫應(yīng)答。1.DNA疫苗介紹DNA疫苗給藥路徑包含：注射、液噴、基因槍、口服和皮內(nèi)接種等。DNA疫苗主要優(yōu)點(diǎn)以下：

載體結(jié)構(gòu)簡單，分子克隆較易；

重組DNA分子穩(wěn)定，可制成凍干疫苗，便于貯運(yùn)

比傳統(tǒng)疫苗更安全，使用過程中不需用佐劑。將幾個(gè)重組質(zhì)粒簡單組合便可制備成多價(jià)疫苗。獸用基因工程生物制品的安全性第21頁2

DNA疫苗安全性問題對DNA疫苗主要擔(dān)憂：重組DNA片段可能整合至宿主DNA而造成插入突變，進(jìn)而可能致癌或致?。患词巩?dāng)前發(fā)覺整合危險(xiǎn)性相當(dāng)?shù)?，但缺乏靈敏有效監(jiān)測伎倆，難得取得準(zhǔn)確和全方面數(shù)據(jù)。對DNA疫苗使用安全性還有一系列問題需說明：

動物體內(nèi)終究是哪些細(xì)胞攝取DNA、在哪些細(xì)胞中表示、表示連續(xù)期有多久？

DNA是否進(jìn)入細(xì)胞核、能否復(fù)制、是否能整合？

外源抗源長久表示能否造成有害免疫病理反應(yīng)？

對DNA注射是否會造成產(chǎn)生對DNA抗體？或引發(fā)本身免疫反應(yīng)？獸用基因工程生物制品的安全性第22頁減毒菌轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品：

主要是活疫苗產(chǎn)品，經(jīng)過轉(zhuǎn)基因減毒菌培養(yǎng)、搜集培養(yǎng)物或離心搜集菌體、加入保護(hù)劑后轉(zhuǎn)入西林瓶、制備液體疫苗或凍干疫苗

要求生產(chǎn)過程嚴(yán)格GMP要求組織生產(chǎn)；

要求產(chǎn)品穩(wěn)定性好、加入保護(hù)劑安全有效，且沒有引入有害物質(zhì)；要求生產(chǎn)和加工活動對轉(zhuǎn)基因生物影響類型為類型2；

所以，轉(zhuǎn)基因活菌產(chǎn)品安全性等同于轉(zhuǎn)基因減毒菌株。

獸用基因工程生物制品的安全性第23頁第三節(jié)獸用基因工程生物制品安全性評價(jià)一、危害性分類標(biāo)準(zhǔn)和安全性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)1.

危害性分類標(biāo)準(zhǔn)第一類危害性：個(gè)體和群體危害性低，不可能引

起健康動物疾病；第二類危害性：中度個(gè)體危害、有限群體危害，

可能引發(fā)動物疾病，正常情況下不會對人

造成嚴(yán)重危害，具備有效治療和預(yù)防辦法第三類危害性：高度個(gè)體危害、低度群體危害，

能引發(fā)嚴(yán)重人或動物疾病，但不會引發(fā)

個(gè)體間傳輸，有預(yù)防和治療伎倆；第四類危害性：高度個(gè)體和群體危害，能致病且

不可預(yù)防或治療，可個(gè)體間及人畜間傳輸。獸用基因工程生物制品的安全性第24頁2.安全性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)第一類制品安全性評價(jià)：評價(jià)重點(diǎn)是生物體分子特征及受體生物基因和缺失或增加基因特征。

分子特征：受體特征、缺失特征、供體基因特征、重組體特征、基礎(chǔ)種子特征

生物學(xué)特征：包含受體、供體和基礎(chǔ)種子生物

學(xué)特征、安全等級及其檢測方法●

第二類制品安全性評價(jià)：評價(jià)重點(diǎn)是缺失基因、疫苗生物和受體生物分子特征和生物學(xué)特征。

分子特征：受體特征、缺失特征、基因缺失體

特征、基礎(chǔ)種子分子特征；

生物學(xué)特征：包含受體和基礎(chǔ)種子生物學(xué)特征、

安全統(tǒng)計(jì)、遺傳穩(wěn)定性及潛在危害性。

獸用基因工程生物制品的安全性第25頁3.第三類制品安全性評價(jià)評價(jià)重點(diǎn)是基因修飾載體活疫苗特征判定和對供體、受體及重組基礎(chǔ)種子分子和生物學(xué)特征判定。分子特征：包含受體、供體、重組生物體和基礎(chǔ)種子分子特征和制備過程中改變。生物學(xué)特征：包含受體、供體和基礎(chǔ)種子生物學(xué)特征，毒力、宿主特異性、遺傳穩(wěn)定性等資料。4.其它制品安全性評價(jià)其它動物用生物制品包含DNA疫苗、干擾素、生化制品等，可參考動物用或植物用轉(zhuǎn)基因微生物要求進(jìn)行評價(jià)。進(jìn)口獸用基因工程生物制品評價(jià)重點(diǎn)，是以控制污染制品進(jìn)口，預(yù)防外來動物疫病進(jìn)入。評價(jià)對象既包含制品本身，也包含其研制和生產(chǎn)過程。

獸用基因工程生物制品的安全性第26頁第四節(jié)獸用基因工程生物制品安全管理獸用基因工程生物制品安全性問題可能出現(xiàn)在研發(fā)、生產(chǎn)、使用、轉(zhuǎn)運(yùn)和廢棄物處理等各個(gè)步驟中，其安全管理也應(yīng)復(fù)蓋上述各個(gè)步驟。獸用基因工程活疫苗在環(huán)境釋放后分子特征、生物學(xué)特征及潛在危險(xiǎn)性表現(xiàn)可能更為顯著。獸用基因工程生物制品安全性問題主要集中于