基因敲除小鼠專家講座

小鼠基因敲除相關(guān)問題介紹基因敲除小鼠專家講座第1頁CONTENTS基因敲除技術(shù)原理介紹1基因敲除小鼠基因型判定2基因敲除小鼠喂養(yǎng)和繁殖3基因敲除小鼠專家講座第2頁基因敲除技術(shù)原理介紹一、基因敲除小鼠專家講座第3頁1.基因敲除技術(shù)介紹基因敲除小鼠技術(shù)(knock-outmousetechnology)是指經(jīng)過基因工程方法使小鼠體內(nèi)某種基因功效缺失生物學(xué)技術(shù)。傳統(tǒng)基因敲除方法有：①插入突變法②同源重組法③RNA干擾(RNAinterference,RNAi)法當(dāng)前在同源重組法基礎(chǔ)上改良基因敲除技術(shù)有：①借助Cre-loxp系統(tǒng)條件型基因敲除法②CRISPR／Cas9技術(shù)（棕褐色AA）（白色）（Aa）（Aa）(AA)(AA)（Aa）（Aa）(aa)基因敲除小鼠專家講座第4頁2.基因敲除技術(shù)步驟2.1胚胎干細(xì)胞分離培養(yǎng)2.1.1首先將129小鼠胚胎分離培養(yǎng)，待胚胎周圍逐步形成ES細(xì)胞集落。2.1.2然后將ES細(xì)胞集落從培養(yǎng)胚胎周圍分離。進行一段時間培養(yǎng)后將ES細(xì)胞集落吸出分散成單個細(xì)胞，將這些單細(xì)胞分離出來進行常規(guī)培養(yǎng)。2.1.3最終對分離培養(yǎng)ES細(xì)胞進行判定。（它應(yīng)該含有正常二倍體核型及體內(nèi)外分化能力）

判定方法①把這種胚胎移植到雌性假孕鼠子宮內(nèi)，是否形成“嵌合體”胚胎。②將ES細(xì)胞注入到同種或免疫缺點性小鼠皮下、睪丸或腎包囊，觀察注入細(xì)胞在宿主動物體內(nèi)是否形成畸胎瘤。③把受試細(xì)胞在體外進行隨機自發(fā)分化或誘導(dǎo)它們向不一樣胚層細(xì)胞分化。普通方法是去除喂養(yǎng)層細(xì)胞后，ES細(xì)胞聚集并形成類胚體。基因敲除小鼠專家講座第5頁2.基因敲除技術(shù)步驟2.2構(gòu)建基因打靶載體依據(jù)需敲除基因序列特點設(shè)計含有2個標(biāo)識篩選基因和特定基因同源臂序列靶向載體。以敲除小鼠Fam172a基因為例：靶向載體Fam172a同源序列靶基因基因敲除小鼠專家講座第6頁2.基因敲除技術(shù)步驟2.3同源重組2.3.1將打靶載體導(dǎo)入129小鼠ES細(xì)胞：當(dāng)前慣用方法有顯微注射法和電穿孔法。2.3.2同源重組篩選：因為哺乳動物細(xì)胞中基因隨機整合機率要遠(yuǎn)大于同源重組，所以需要利用選擇性標(biāo)識基因?qū)l(fā)生同源重組細(xì)胞篩選出來，當(dāng)前慣用篩選方法有正負(fù)雙向選擇法。基因敲除小鼠專家講座第7頁正負(fù)雙向選擇法neo:正向選擇基因。含有新霉素(G418)抗性，其在發(fā)生隨機組合和同源重組細(xì)胞中都可以表示。HSV-tk：負(fù)向選擇基因。在發(fā)生同源重組時別剪切掉，發(fā)生隨機組合時被保留。tk基因可使無毒丙氧鳥苷（GANC）轉(zhuǎn)化為毒性核苷酸而殺死細(xì)胞。neo基因保留，tk基因被切除對G418和GANC都有抗性對G418有抗性，對GANC敏感neo、tk基因均被保留靶向載體篩選出中靶ES基因敲除小鼠專家講座第8頁2.基因敲除技術(shù)步驟2.4基因敲除小鼠產(chǎn)生2.4.1將中靶ES細(xì)胞注入到BALB/c小鼠囊胚，接種到新培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)。2.4.2將正常發(fā)育含ES細(xì)胞囊胚移植入受體小鼠子宮內(nèi)2.4.3嵌合體小鼠判別：經(jīng)過觀察小鼠被毛顏色就可確定嵌合體小鼠。2.4.4基因敲除小鼠制備：因為在同源重組過程中，ES細(xì)胞2條染色體中普通只有1條進行重組，得到嵌合體小鼠后，還要經(jīng)過最少2代繁育過程才能得到基因敲除小鼠。基因敲除小鼠專家講座第9頁基因敲除小鼠基因型判定二、基因敲除小鼠專家講座第10頁1.利用PCR和瓊脂糖凝膠電泳判定1.1提取小鼠尾部DNA組織1.2PCR擴增與瓊脂糖凝膠電泳判定基因型1.2.1針對不一樣Fam172a+/-，F(xiàn)am172a-/-，WT設(shè)計不一樣引物

1.2.2采取PCR儀進行擴增：變性→退火→延伸

1.2.3取PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳

1.2.4依據(jù)凝膠成像儀中條帶判別基因型可能結(jié)果分析

Fam172a+/-出現(xiàn)兩條帶，F(xiàn)am172a-/-只出現(xiàn)一條帶，WT出現(xiàn)一條帶，但Fam172a-/-和WT出現(xiàn)位置不同?；蚯贸∈髮＜抑v座第11頁2.利用WB測定組織中FAM172a蛋白水平2.1提取小鼠尾部組織蛋白2.2BCA法檢測蛋白濃度2.3WB分析可能出現(xiàn)結(jié)果：

WT小鼠條帶灰度最高；

Fam172a+/-條帶灰度值其次；

Fam172a-/-無條帶出現(xiàn)。基因敲除小鼠專家講座第12頁基因敲除小鼠喂養(yǎng)與繁殖三、基因敲除小鼠專家講座第13頁1.喂養(yǎng)基因鼠屬SPF級別動物（指機體內(nèi)無特定微生物和寄生蟲存在動物，但非特定微生物和寄生蟲是允許存在。普通指無傳染病健康動物，是當(dāng)前國外使用最廣泛試驗動物）它起源，既可來自無菌動物繁育后代，亦可經(jīng)剖胎取后，在隔離屏障設(shè)施環(huán)境中，由SPF親代動物撫育。小鼠房舍：最好選擇能耐藥液沖冼、隔音性強、無害蟲棲息地方，面積不宜過大。墊料：應(yīng)選擇吸濕性好（如鋸木屑）屏障溫度：20～25℃濕度：40％～70％照明時間：天天明暗循環(huán)12小時。小鼠鼠籠、飼料、墊料和飲水均經(jīng)高溫高壓消毒滅菌處理來預(yù)防微生物感染，小鼠自由攝食飲水，墊料每七天定時更換3次。幼鼠由母鼠母乳喂養(yǎng)，產(chǎn)后18-22天離乳，雌雄分籠。基因敲除小鼠專家講座第14頁2.繁殖留種：普通選擇同胎產(chǎn)仔10只以上、發(fā)育良好、均勻、無死亡，適當(dāng)延長哺乳期至18一22天,體重在18克以上者留種。選出同胎仔鼠將公母分開,放入消毒好鼠籠內(nèi),每籠3一5只,切記做好標(biāo)識,待第一次換窩時再進行復(fù)選,按1:1百分比進行選留,區(qū)分雌雄,淘汰多出仔鼠。如此重復(fù)兩三次,效果更佳,首先提升種鼠質(zhì)量,另方面可防公母混雜,造成早配,影響繁殖率。配種①嚴(yán)格控制動物房燈光：早6到晚6保持照明，晚6到早6保持黑暗，這種光照對對小鼠配種率極為主要。②盡可能不要用嵌合體自交，應(yīng)選取雜合體進行交配繁殖。③因為小鼠夜間活動力強,正常交配發(fā)生于夜晚,故可選3月齡以上、1年以內(nèi)母鼠于黃昏前放入公鼠籠內(nèi)合籠。育種①適當(dāng)增加飼料營養(yǎng)成份，如葵花籽、麥芽等