免疫共沉淀原理和注意事項

免疫共沉淀原理和注意事項免疫共沉淀原理和注意事項第1頁一試驗原理以（抗體和抗原）之間專一性作用為基礎(chǔ)用于研究（蛋白質(zhì)相互作用）經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整（細胞內(nèi)生理性）相互作用有效方法。假如用蛋白質(zhì)X抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來。

問題：細胞怎樣保持生理狀態(tài)-不變性？Y-X-抗X免疫共沉淀原理和注意事項第2頁CO-IP應用與IP區(qū)分測定兩種目標蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合確定一個特定蛋白質(zhì)新作用搭檔CO-IP與IP只取決于檢測焦點是初級靶分子（抗原）還是次級靶分子（相互作用蛋白）免疫共沉淀原理和注意事項第3頁試驗基礎(chǔ)原理1.提取蛋白2.在細胞裂解液中加入抗X抗體3.孵育后再加入ProteinA或G(于Agarosebead上)若細胞中有與興趣蛋白結(jié)合目標蛋白，就能夠形成復合物：“Y—X—抗X抗體—ProteinA或G"3.經(jīng)變性、聚丙烯酰胺凝膠電泳，復合物又被分開。（xy抗原、x抗體）proteinA/G有一個很主要特征就是能與抗體Fc段結(jié)合agarosebead瓊脂糖珠免疫共沉淀原理和注意事項第4頁CO-IP原理圖解免疫共沉淀原理和注意事項第5頁proteinA/G-瓊脂糖珠復合物ProteinA是一個金黃色葡萄球菌細胞壁蛋白質(zhì)，能特異性地與人和哺乳動物抗體（主要是IgG）Fc區(qū)結(jié)合。當前多用proteinA/G預先結(jié)合在argarosebeads上。免疫共沉淀原理和注意事項第6頁ProteinA/G作用及詳細原理“捕捉”抗體，形成復合物，抗體-目標蛋白-ProteinA/Gbeads非共價健結(jié)合ProteinA/G-garosebeads共價結(jié)合加樣緩沖液-煮沸變性-離心ProteinA/Gbeads↓EP管（抗體-目標蛋白-少許非特異性吸附蛋白）。免疫共沉淀原理和注意事項第7頁二CO-IP特征優(yōu)點（1相互作用蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾，處于天然狀態(tài)（2蛋白相互作用是在自然狀態(tài)下進行，能夠防止人為影響（3能夠分離得到天然狀態(tài)相互作用蛋白復合物免疫共沉淀原理和注意事項第8頁二CO-IP特征不足（1可能檢測不到低親和力和瞬間蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用（2兩種蛋白質(zhì)結(jié)合可能不是直接結(jié)合，有第三者在中間起橋梁作用；（3必須在試驗前預測目標蛋白是什么，以選擇最終檢測抗體，若預測不正確，試驗就得不到結(jié)果。免疫共沉淀原理和注意事項第9頁三試驗流程

提取細胞總蛋白↓

↓離心，上清電泳(抗原抗體)準備PA珠子，PBS洗3遍↓PA珠子加入蛋白裂解液（去除非特異性蛋白背景)↓離心去PA珠子，取上清↓測蛋白濃度(BCA法)↓加一抗反應(4℃過夜)↓加PA珠子捕捉復合物(室溫1h或4℃過夜)↓離心，搜集沉淀，預冷RIPABuffer洗3遍↓上樣緩沖液懸浮沉淀，加熱游離抗原、抗體、珠子

↓

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免疫共沉淀原理和注意事項第10頁四試驗結(jié)果分析SDSWesternblotting分析質(zhì)譜分析檢測目標蛋白免疫共沉淀原理和注意事項第11頁SDS結(jié)果分析標難曲線只對同一塊凝膠上樣品分子量測定才含有可靠性。以每個蛋白標準分子量對數(shù)對它相對遷移率作圖得標準曲線，量出未知蛋白遷移率即可測出其分于量。

免疫共沉淀原理和注意事項第12頁一抗一抗一抗(兔抗Actin)

曝光后蛋白條帶二抗(辣根酶標識羊抗兔IgG)ECLX光片曝光顯影ECL試劑含有轉(zhuǎn)印蛋白PVDF膜

++轉(zhuǎn)印膜上蛋白檢測示意圖

WB結(jié)果分析免疫共沉淀原理和注意事項第13頁CO-IP與質(zhì)譜分析流程免疫共沉淀原理和注意事項第14頁三試驗關(guān)鍵1.試驗最需要注意點就是抗體性質(zhì)。尤其是多抗特異性是問題。2.為預防蛋白分解、修飾，溶解抗原緩沖液必須加蛋白酶抑制劑，低溫下進行試驗。3.考慮抗體/緩沖液百分比?？贵w過少就不能檢出抗原，過多則就不能沉降在beads上，殘余在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原，過多則抗原被稀釋。4.確定蛋白間相互作用是發(fā)生在細胞中，而不是因為細胞溶解才發(fā)生，這需要進行蛋白質(zhì)定位來確定。？？免疫共沉淀原理和注意事項第15頁注意問題：1.裂解液細胞裂解采取溫和裂解條件，不能破壞細胞內(nèi)存在全部蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用，多采取非離子變性劑（NP40或TritonX-100)。每種細胞裂解條件是不一樣，經(jīng)過經(jīng)驗確定。不能用高濃度變性劑（0.2％SDS)，細胞裂解液中要加各種酶抑制劑，如商品化cocktailer。免疫共沉淀原理和注意事項第16頁RIPA裂解液--普利萊基因技術(shù)有限企業(yè)100mlRIPABuffer：50mMTris-HCl(pH7.4),150mMNaCl,1%NP-40,0.1%SDS.（100元）說明：1.裂解液臨用前可新鮮加入最終濃度為1mMPMSF或其它蛋白酶抑制劑。2.RIPA裂解液中蛋白樣品含有較高濃度去垢劑，不能用Bradford法但可用BCA法或改良Lowry法測定蛋白濃度免疫共沉淀原理和注意事項第17頁裂解液成份我國博士：細胞裂解液：50mMTris-HC（lpH7.5），150mMNaCl,0.5%NP-40,1mMEDTA使用前加入PMSF至終濃度1mM、proteinaseinhibitorcocktail（混合物）。劉巖BC300buffer20mMTris-Cl,pH8.0,300mMNaCl,0.2mMEDTA,10%glycerol（甘油）,0.2mMPMSF,0.2%Tween20免疫共沉淀原理和注意事項第18頁2.1免疫沉淀中抗體選擇免疫共沉淀原理和注意事項第19頁注意問題：2.2抗體使用對照抗體：（陰性和陽性）陰性：

單克隆抗體：同一個屬IgG

兔多克隆抗體：正常兔IgG陽性：細胞內(nèi)某種蛋白抗體（做膜蛋白A，用膜蛋白B）免疫共沉淀原理和注意事項第20頁未檢測到目得蛋白或蛋白極少可能原因 處理方法1.樣品被蛋白酶降解：添加蛋白酶抑制劑；全部操作保持4℃以下冰上操作并預防凍融2.抗體濃度太低：調(diào)整抗體濃度，必要時設置濃度梯度，探索最正確濃度3.抗抗體親協(xié)力太低：選取適合于IP和/或IB對應抗體4.IP抗體未與agarose珠子結(jié)合：選取適合于IP對應珠子，正確保留預防變質(zhì)或干燥5.Tag未暴露在融合蛋白構(gòu)象表面：改變tag融合表示部位6.裂解液嚴謹度太高：改用低嚴謹度裂解液免疫共沉淀原理和注意事項第21頁目得蛋白高背景：可能原因 處理方法非特異蛋白結(jié)合 在無血清培養(yǎng)液中裂解細胞；在免疫沉淀前用protein(G/A)珠子預洗，免疫沉淀后增加漂洗次數(shù)和嚴謹度（高鹽或去垢劑）裂解液嚴謹度太低 改用高嚴謹度裂解液試驗儀器或液體被污染 使用潔凈儀器或液體轉(zhuǎn)移膜上非特異吸附 戴手套，用鑷子夾取，不要接觸膜轉(zhuǎn)移面免疫共沉淀原理和注意事項第22頁試劑RIP