用wssv人工感染螯蝦的初步研究

用wssv人工感染螯蝦的初步研究

蝦白蝦綜合征（wssv）是蝦白蝦貨發(fā)性流行病的主要病因，具有廣泛的主觀優(yōu)勢(shì)。在靠近海岸和蝦池的大多數(shù)地方，都可以找到陽性。到目前為止,由于適合對(duì)蝦病毒的細(xì)胞系尚未建立,以對(duì)蝦為實(shí)驗(yàn)材料成本較高,且?guī)Ф菊叨?不宜作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,尋找適合該病毒的廉價(jià)的近緣動(dòng)物作為研究對(duì)蝦病毒的動(dòng)物模型是十分必要的。螯蝦是淡水甲殼動(dòng)物,一年四季均可取材,價(jià)格低廉,本文進(jìn)行了WSSV對(duì)螯蝦的人工感染,并進(jìn)行了組織細(xì)胞病理變化的觀察和病毒的檢測(cè)。1材料和方法1.1確認(rèn)后實(shí)驗(yàn)螯蝦購自市場(chǎng),平均體重約20g,挑選活力強(qiáng)的個(gè)體暫養(yǎng)于水槽中,飼養(yǎng)溫度24~25℃。1.2kso4-u300022h2oWSSV感染發(fā)病致死的中國對(duì)蝦,保存于-35℃。取病蝦頭胸部,去頭胸甲和肝胰腺,稱取10g加少許PPB緩沖液(376mmol/LNaCl,7.5mmol/LK2SO4,12.8mmol/LCaCl2·2H2O,6.5mmol/LMgSO4·7H2O,50mmol/LTris·HCl,pH7.2)冰浴研磨勻漿;10000r/min4℃離心15min;上清液于24000r/min4℃離心2h;沉淀懸浮于3倍體積的PPB,10000r/min4℃離心5min;上清液經(jīng)35%(W/W)蔗糖墊100000r/min4℃離心3h,沉淀溶于100mlPPB,作為注射感染實(shí)驗(yàn)的病毒液。1.3注射感染暫養(yǎng)后的螯蝦隨機(jī)分組,分別于第1,2腹節(jié)肌肉注射0.1ml的病毒液,對(duì)照組注射PPB。1.4病毒核電廠的混合點(diǎn)雜交探針為DIG標(biāo)記的700bp大小的WSSV特異性DNA片段。取螯蝦的鰓、胃區(qū)組織和血淋巴,以SEMP-SSC采樣液1.5石蠟切片觀察取螯蝦的鰓和胃用Davidson′sFAA液固定,按常規(guī)方法制備石蠟切片,在顯微鏡下觀察。同時(shí)用2.5%戊二醛固定螯蝦的鰓和胃,制備超薄切片,進(jìn)行電鏡觀察。1.6wssv探針法原位雜交探針為DIG標(biāo)記的547bp的WSSV特異性DNA片段。石蠟切片貼附于帶正離子的載玻片上烘干,于二甲苯脫蠟,復(fù)水,經(jīng)蛋白酶K消化,用冷甲醛終止反應(yīng),取出與雜交緩沖液孵育后加入DIG標(biāo)記的WSSV探針雜交過夜,洗滌,封閉液封閉,與堿性磷酸酶-抗DIG抗體反應(yīng),顯色,封片后以顯微鏡觀察。2結(jié)果2.1血淋巴型克氏原螯蝦感染螯蝦于3~6d內(nèi)全部死亡。發(fā)病螯蝦初期無明顯癥狀,后期不攝食,反應(yīng)遲鈍,螯肢無力;瀕死螯蝦血淋巴不凝固、微紅,頭胸甲易剝離,肝胰腺顏色淡黃,腹節(jié)肌肉蒼白。對(duì)照組螯蝦全部存活,無異常癥狀。2.2核酸探針檢測(cè)用核酸探針點(diǎn)雜交方法對(duì)感染組螯蝦的鰓、胃組織和血淋巴進(jìn)行兩次檢測(cè)(表1),在硝酸纖維膜上,出現(xiàn)黑褐色的斑點(diǎn)為陽性,無顯色反應(yīng)的為陰性(圖1-5)。結(jié)果表明核酸探針點(diǎn)雜交具有較高的重復(fù)性;在進(jìn)行雜交檢測(cè)時(shí),鰓和胃是較適宜的組織。2.3電鏡觀察與病毒粒子檢測(cè)瀕死螯蝦的鰓和胃經(jīng)H.E染色后在顯微鏡下觀察,可觀察到上皮細(xì)胞、結(jié)締組織細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞、血細(xì)胞的細(xì)胞核均顯著腫大,核內(nèi)有均勻的嗜酸性物質(zhì),染色質(zhì)與核仁消失;細(xì)胞胞質(zhì)渾濁,細(xì)胞膜輪廓模糊,組織結(jié)構(gòu)松散殘缺,呈現(xiàn)組織壞死狀態(tài)(圖1-4)。對(duì)照組螯蝦鰓、胃組織細(xì)胞中未觀察到均勻著色的病變細(xì)胞,細(xì)胞核形態(tài)瘦狹,核內(nèi)染色質(zhì)、核仁呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),與核質(zhì)反差明顯,核膜、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)清楚,細(xì)胞形態(tài)清晰可辨,組織結(jié)構(gòu)完整。在電鏡下,感染螯蝦的胃、鰓組織細(xì)胞核可觀察到桿狀病毒粒子。病毒粒子橫切面為圓形,縱切面為桿狀而略帶橢圓,外被囊膜,囊膜為雙層結(jié)構(gòu),有些病毒頂端有乳頭狀結(jié)構(gòu)(圖1-2)。其形態(tài)大小與描述的WSSV一致。某些病變嚴(yán)重的細(xì)胞核幾乎被桿狀粒子充滿,并有長晶格狀物出現(xiàn),核內(nèi)染色質(zhì)消失(圖1-1)。胞質(zhì)核糖體顆粒脫落,線粒體、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等結(jié)構(gòu)潰散,僅見膨大裸露的細(xì)胞核;有的核膜破裂,病毒粒子釋放出來;在有些細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見有細(xì)菌的混合感染。對(duì)照組螯蝦細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)完整,未見有桿狀病毒粒子。2.4細(xì)胞核均勻著對(duì)螯蝦病理組織石蠟切片進(jìn)行病毒核酸原位雜交檢測(cè),細(xì)胞核均勻著紫藍(lán)色者為陽性病變細(xì)胞,未著色細(xì)胞為陰性。經(jīng)過兩次檢測(cè),在檢測(cè)的10個(gè)樣品中,發(fā)病螯蝦的胃、鰓均為陽性(圖1-3),對(duì)照組均為陰性。3核酸探針點(diǎn)雜交分析本文采用光鏡、電鏡進(jìn)行組織病理學(xué)觀察,同時(shí)應(yīng)用核酸點(diǎn)雜交和原位雜交檢測(cè)病毒的特異性,結(jié)果均表明了WSSV可感染淡水螯蝦。螯蝦可作為進(jìn)一步研究WSSV的模式動(dòng)物。用于檢測(cè)病毒的方法很多,光鏡和電鏡方法是觀察組織病理變化和和病毒作用過程常用的方法,這兩種方法都是在病毒感染、大量增殖后才能觀察到,當(dāng)感染早期或潛伏期病毒量較少時(shí),難以觀察到病毒的存在。將病毒粒子的特異性核酸片段進(jìn)行標(biāo)記,在硝酸纖維膜上與組織中提取的病毒核酸雜交,可提高病毒檢測(cè)的靈敏度,但由于核酸探針點(diǎn)雜交分析法是對(duì)從發(fā)病螯蝦組織提取的病毒DNA進(jìn)行檢測(cè),病毒DNA的含量直接影響檢測(cè)的靈敏度,特別是病毒量少的帶毒者更難以檢測(cè)到。因此為了提高病毒檢測(cè)的特異性和靈敏度,目前普遍采用固定組織核酸原位雜交方法,這種方法無需提取組織的病毒DNA,依然保持組織與細(xì)胞形態(tài)的完整性,用核酸探針直接檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的靶核酸序列,對(duì)細(xì)胞中含量極低的靶序列有極高的敏感性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明了核酸原位雜交方法比點(diǎn)雜交具有較高的靈敏