葉綠素的提取實驗報告

葉綠素的提取及葉綠素銅鈉的合成及測定生物資源系食衛(wèi)101韋琪（20102023）指導(dǎo)老師：張倩、劉新梅一、實驗?zāi)康?.從蠶沙中提取葉綠素并計算提取率；2.研究用葉綠素合成葉綠素銅鈉的工藝條件；3.分析葉綠素銅鈉產(chǎn)品的純度，計算產(chǎn)率；4.通過試驗提高綜合能力及練習(xí)鞏固各種相關(guān)操作。二、實驗原理蠶沙是桑蠶的排泄物，由蠶沙制取天然色素——葉綠素酮鈉鹽，是國外普遍采用的最佳途徑。葉綠素是一種酯，因此不溶于水，而溶于乙醇、丙酮、乙醚等有機(jī)溶劑。葉綠素是植物吸收太陽能進(jìn)行光合作用的主要色素，葉綠素是一種含有卟吩環(huán)的天然色素，在葉綠素的結(jié)構(gòu)中，含有一個由四個吡咯環(huán)和四個次甲基交替相聯(lián)形成的卟吩環(huán)．卟吩環(huán)閉合的共軛體系提供了包圍鎂離子(或其它相似離子)的剛性平面．高等植物中含有葉綠素a和葉綠素b分子式如下：蠶沙中含有豐富的葉綠素，其純含量達(dá)0.8—1.0%，居所有天然色素之首，故可用蠶沙來提取葉綠素，由于葉綠素易溶于乙醚、苯、丙酮、乙醇的脂性溶劑，故可用乙醇、丙酮混合液來提取。所得的葉綠素由于遇熱、光、酸、堿等易分解，且又不溶于水。110度左右會分解，故把葉綠素制備成葉綠素銅鈉，其性質(zhì)更穩(wěn)定溶解性也會有所提高。 葉綠素分子中的鎂原子和四個吡咯上的氮原子相結(jié)合，環(huán)上是雙羧酸的酯，一個被四所酯化，另一個被葉醇基所酯化，故可以發(fā)生皂化反應(yīng)生成鈉鹽：C55H72MgN4O5+2NaOHC34H30O5N4MgNa2+CH3OH+C20H39OH在酸性介質(zhì)中，葉綠素鈉鹽分子中的鎂極易被氫原子取代生成褐色的葉綠素酸：C34H30O5N4MgNa2+4H+C34H34O5N4+Mg2++2Na+葉綠素酸可與銅鹽加熱條件下生成葉綠素銅酸析出，將葉綠素銅酸溶于丙酮，再與堿反應(yīng)就生成葉綠素銅鈉鹽：C34H34O5N4+Cu2+C34H34O5N4Cu+2H+C34H34O5N4Cu+2NaOHC34H34O5N4CuNa2+2H2O由葉綠素轉(zhuǎn)化成葉綠素銅鈉的過程也可用化學(xué)反應(yīng)方程表示：（1）皂化：COOCH3COONaC32H30ON4Mg+2NaOH→C32H30ON4Mg+CH3OH+C20H39OHCOOC20H39COONa（2）酸化：COONaCOOHC32H30ON4Mg+2H2SO4→C32H30ON4H2+MgSO4+NaSO4COONaCOOH（3）銅代：COOHCOOHC32H30ON4H2+CuSO4→C32H30ON4Cu+H2SO4COOHCOOH（4）成鹽：COOHCOONaC32H30ON4Cu+2NaOH→C32H30ON4Cu+2H2OCOOHCOONa三、實驗儀器和試劑1.儀器：（一個），分液漏斗（2個）,250mL錐形瓶（1個），燒杯（100ml、250mL、500mL）各1個，容量瓶（100mL、250mL）各1個，蒸餾裝置，減壓過濾裝置，玻璃棒，電子天平，圓底燒瓶（250mL）2個，酸度計，分光光度儀（一臺）。2.試劑：（50g）、95%乙醇，丙酮，石油醚，2%～5%NaOH乙醇溶液，硫酸銅溶液，無水乙醇，稀鹽酸，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀。四、實驗流程 蠶沙——預(yù)處理——浸提（三次，分別是3h,1h,1h）——抽濾——濃縮——萃取液皂化——分離——萃取——調(diào)PH值——銅化——抽濾——離析——沉淀——烘干——純化——成鹽——過濾——成品五、實驗步驟葉綠素原料→極性有機(jī)溶劑萃取→過濾→萃取液→皂化→非極性有機(jī)溶劑萃取除去脂溶劑性質(zhì)→葉綠素鹽溶液→酸化形成葉綠素酸→→銅代→加氫氧化鈉形成葉綠素銅鈉→洗滌干燥→檢驗純度及質(zhì)量。（1）蠶沙預(yù)先處理：將50g蠶沙放入打磨機(jī)中打磨粉碎。（2）從蠶沙中提取葉綠素：加入乙醇-丙酮混合液（1:1）150ml于40~45°C提取3~5h，抽濾，濾渣再用同等體積乙醇-丙酮的混合液提?。?）葉綠素的皂化：合并兩次提取液并加5%的NaOH-乙醇水溶液調(diào)pH值為11，水浴加熱(50-60°c)皂化回流1h左右。皂化目的是為了除去甲基和葉綠基酯基，即向溶液中加入NaOH溶液，在溫度為50-60°（4）回收，洗滌：皂化完畢后，蒸餾回收混合液（60°（5）葉綠素酸中的銅代：石油醚下層液用稀鹽酸溶液調(diào)pH值為7后，加入2-3mlCuSO4溶液，再用稀鹽酸將溶液調(diào)節(jié)pH值為2。在50°（6）洗滌：室溫下收集沉淀，先用50~60°（7）溶解成鹽：靜置4小時后，用抽濾瓶進(jìn)行抽濾，濾餅用丙酮溶解，再加入5%的NaOH-乙醇溶液pH值為12（相當(dāng)于100g葉綠素銅酸約加入20gNaOH），皂化回流1小時，成鹽（過程是先呈粘稠狀，隨著NaOH的加入,漸漸變稀,直到pH達(dá)到11時又復(fù)變稠），可用濾紙法檢驗成鹽情況：用玻棒點少許溶液放在濾紙上，濾紙不顯綠色則說明完全成鹽。（8）過濾干燥：靜置過濾，收集沉淀，用無水乙醇洗滌，然后在60°C~80°C下烘箱中烘干結(jié)晶物，粉碎即得葉綠素銅鈉鹽。稱量，計算產(chǎn)率。（9）純度分析：1、標(biāo)準(zhǔn)葉綠素銅鈉鹽的標(biāo)準(zhǔn)曲線：用電子天平稱取標(biāo)準(zhǔn)樣品0.0100g，加水溶解。轉(zhuǎn)入10mL容量瓶中定容，搖勻。準(zhǔn)確取1mL溶液以pH為7.5的磷酸鹽緩沖液定容為100mL，搖勻，即為0.001%溶液。用分光光度計測定，在15分鐘內(nèi)用1cm的比色杯，在405nm波長處測定溶液的吸光值A(chǔ)（每隔10nm測定一次），以緩沖液作空白對照。類似地，配制0.0005%,0.00075%,0.001%，0.005%,0.0075%濃度的溶液，用分光光度計測定，在15分鐘內(nèi)用1cm的比色杯，在405nm波長處測定溶液的吸光值A(chǔ)（每隔10nm測定一次），以緩沖液作空白對照，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2、標(biāo)準(zhǔn)葉綠素銅鈉鹽的吸收曲線：取1中配置好的0.001%的溶液，用分光光度計測定，在15分鐘內(nèi)用1cm的比色杯，在360nm～700nm波長處測定溶液的吸光值A(chǔ)（每隔10nm測定一次），以緩沖液作空白對照。記錄數(shù)據(jù),并繪制吸收曲線。3、產(chǎn)品葉綠素銅鈉鹽的吸光比測定：稱取烘干成品0.100g（精確至0.0002g），加水溶解，移入10mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻。從容量瓶中準(zhǔn)確取2.00mL溶液移入50mL容量瓶，用pH=7.5磷酸鹽緩沖液定容至刻度，搖勻，即為0.004%溶液，此液最大吸收峰為405nm與630nm。以緩沖溶液為空白液，用分光光度計測定，在350nm-700nm波長處測定溶液吸光值A(chǔ)（每隔5nm或10nm測定一次），記錄數(shù)據(jù)，繪制吸光曲線。六、注意事項：1.水浴加熱時溫度控制不宜加熱過快；2.減壓蒸餾時對壓力的要求不能過高；3.保證浸潤時間足夠、提取完全；4.實驗操作的規(guī)范及安全問題；5.要調(diào)節(jié)好溶液中pH值大??；6.實驗操作的規(guī)范及安全問題。七、試驗記錄表1實驗現(xiàn)象記錄試驗操作試驗現(xiàn)象備注稱取干燥粉碎的蠶沙50.00g蠶沙表面灰綠色，粗糙，呈六棱形，粉碎后變成粉末狀粉末中不能有過多的顆粒存在加入蒸餾水潤濕，再加入95%乙醇，用磁力攪拌器再60度下加熱攪拌2h，抽濾，棄去濾渣，保存濾液得到墨綠色濾液和黑色濾渣使用雙層濾紙重復(fù)回流兩次抽濾，棄去濾渣，合并濾液得到墨綠色濾液和黑色濾渣使用雙層濾紙把濾液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，并在55-60℃加熱蒸餾回收95^%乙醇得到無色透明的回收乙醇和墨綠色濃縮液燒杯壁上沾喲墨綠色物質(zhì)在濃縮液5%NaOH-C2H5OH，調(diào)節(jié)PH=11-12,溫度為55℃，皂化時為3溶液的實際pH=11.35，且溶液中有小氣泡皂化過程皂化后用石油醚萃取雜質(zhì)，棄去上層液分層，上層黃綠色，下層綠色除雜除雜后的皂化液加HCl調(diào)，PH＝7加入10%CuSO4調(diào)PH＝2－3，在攪拌下溫度55℃，保持1h加HCl得pH＝7.05加入硫酸銅溶液pH=2.12，溶液中現(xiàn)膠狀墨色懸浮物銅代過程靜置過濾，收集沉淀，用無水乙醇洗滌，然后在60°C~80°C下烘箱中烘干結(jié)晶物，粉碎即得葉綠素銅鈉鹽。60℃烘干得0.9578g得墨綠色物質(zhì)洗滌液呈綠色去離子水呈綠色固體溶解得綠色液體得墨綠色粉末成鹽過程稱取0.100g葉綠素銅鈉溶于蒸餾水配成1%溶液，測其pH值溶液呈教亮的深綠色溶解后用PH=7.5的緩沖液定容表2標(biāo)準(zhǔn)樣品葉綠素銅鈉鹽吸收曲線的測定數(shù)據(jù)表波長360370380390400405410吸光度0.2510.2520.2630.2820.3150.3240.326波長420430440450460470480吸光度0.3010.2530.2130.1870.1660.1440.137波長490500510520530540550吸光度0.1250.1170.1180.1120.1070.1010.104波長560570580590600610620吸光度0.0970.1010.0930.0940.1040.0970.098波長630640650660670680690吸光度0.1060.1130.1120.1120.1060.0920.083波長700吸光度0.076表3葉綠素銅鈉鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定數(shù)據(jù)表（光波長405nm）溶液百分?jǐn)?shù)（%）0.00050.2110.00100.3240.00150.4920.00200.574

附表一：標(biāo)準(zhǔn)葉綠素銅鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線附表二：產(chǎn)品葉綠素銅鈉吸收曲線產(chǎn)品葉綠素銅鈉產(chǎn)品葉綠素銅鈉吸收曲線y=181.5x+0.1202500.20.40.60.80.00050.0010.00150.002溶液百分含量吸光度A附表三:405nm波長下葉綠素標(biāo)準(zhǔn)曲線八、實驗數(shù)據(jù)處理（1）所得產(chǎn)品質(zhì)量m=0.實驗用蠶沙質(zhì)量m=50.00g，故產(chǎn)率為：w=0.03g/50.00gx100%=0.06%（2）產(chǎn)品葉綠素銅鈉純度：當(dāng)A405nm=0.324,由標(biāo)準(zhǔn)曲線得溶液的百分量，即x=(0.324-0.12025)/181.5=0.1123%.產(chǎn)品純度：∩=0.1123%/0.06%=1.87（3）A405nm=0.324A630nm=0.034吸光比：A405nm/A630nm=0.324/0.034=9.53九、實驗討論攪拌萃取的時間不足，浸提的時間不足，浸提不夠充分。皂化不夠充分，雖然皂化的時間比較長，但效果還是不明顯，可能是由于皂化時PH值沒調(diào)節(jié)好以及溫度沒控制好。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸餾回收乙醇的時間不足，使得濃縮液中殘留過多的乙醇，把葉綠素溶解在其中，不利于后來對葉綠素的提取。在實驗過程中加入各種試劑的量控制不是非常精確，調(diào)節(jié)PH也有偏差，使得提取的葉綠素存在較多的雜質(zhì)。整個實驗過程中洗滌、過濾和轉(zhuǎn)移的次數(shù)比較多，使得產(chǎn)品損失較大。葉綠素結(jié)晶過程中，由于烘干不夠充分，導(dǎo)致晶體中水分較多，產(chǎn)品純度低。萃取前，應(yīng)取一些皂化液驗證是否皂化完全，如果出現(xiàn)明顯分層現(xiàn)象，則說明皂化完全，但我們在實驗過程中，雖然進(jìn)行了多次較長時間的皂化，可還是無法出現(xiàn)明顯的分層，初步分析原因應(yīng)為皂化過程中PH值調(diào)節(jié)不好。本次實驗測得的吸光度值與相對標(biāo)準(zhǔn)的吸收曲線有偏差，原因可能有：（1）所制備的產(chǎn)品純度較低；（2）產(chǎn)品沒有完全烘干。十、實驗心得與體會這一次實驗在操作過程中出現(xiàn)了一些問題，使得實驗存在一些誤差，包括人為的操作失誤，偶然的誤差和系統(tǒng)誤差，表現(xiàn)為繪制出來的樣品葉綠素銅鈉鹽吸收曲線最大吸收峰與理論值有所偏差以及產(chǎn)品純度不高。通過這次實驗，我對各種儀器的使用有了更進(jìn)一步的了解，對基本的實驗操作也有了更深刻的認(rèn)識，學(xué)會了獨立思考和自己設(shè)計實驗的能力，學(xué)會了怎樣設(shè)計和操作一個完整的實驗。我在這次實驗中收獲很大，使我受益匪淺。十一、參考文獻(xiàn)：[1]曾昭瓊．有機(jī)化學(xué)[M]．北京：高等教育出版社，1997564-565．[2]楊昆山．配位化學(xué)[M]．成都：四川大學(xué)出版社，1987．270-273．[3]楊繼生，何學(xué)志，揚州大學(xué)化學(xué)化工系，葉綠素銅鈉鹽的性質(zhì)，制備工藝及應(yīng)用，廣州食品工業(yè)科技，2002-(1)-(27)[4]王正平，單旭峰，哈爾濱工程大學(xué)化工學(xué)院，葉綠素銅鈉的制備及穩(wěn)定