葉綠素的提取實(shí)驗(yàn)報(bào)告

葉綠素的提取及葉綠素銅鈉的合成及測(cè)定生物資源系食衛(wèi)101韋琪（20102023）指導(dǎo)老師：張倩、劉新梅一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.從蠶沙中提取葉綠素并計(jì)算提取率；2.研究用葉綠素合成葉綠素銅鈉的工藝條件；3.分析葉綠素銅鈉產(chǎn)品的純度，計(jì)算產(chǎn)率；4.通過(guò)試驗(yàn)提高綜合能力及練習(xí)鞏固各種相關(guān)操作。二、實(shí)驗(yàn)原理蠶沙是桑蠶的排泄物，由蠶沙制取天然色素——葉綠素酮鈉鹽，是國(guó)外普遍采用的最佳途徑。葉綠素是一種酯，因此不溶于水，而溶于乙醇、丙酮、乙醚等有機(jī)溶劑。葉綠素是植物吸收太陽(yáng)能進(jìn)行光合作用的主要色素，葉綠素是一種含有卟吩環(huán)的天然色素，在葉綠素的結(jié)構(gòu)中，含有一個(gè)由四個(gè)吡咯環(huán)和四個(gè)次甲基交替相聯(lián)形成的卟吩環(huán)．卟吩環(huán)閉合的共軛體系提供了包圍鎂離子(或其它相似離子)的剛性平面．高等植物中含有葉綠素a和葉綠素b分子式如下：蠶沙中含有豐富的葉綠素，其純含量達(dá)0.8—1.0%，居所有天然色素之首，故可用蠶沙來(lái)提取葉綠素，由于葉綠素易溶于乙醚、苯、丙酮、乙醇的脂性溶劑，故可用乙醇、丙酮混合液來(lái)提取。所得的葉綠素由于遇熱、光、酸、堿等易分解，且又不溶于水。110度左右會(huì)分解，故把葉綠素制備成葉綠素銅鈉，其性質(zhì)更穩(wěn)定溶解性也會(huì)有所提高。 葉綠素分子中的鎂原子和四個(gè)吡咯上的氮原子相結(jié)合，環(huán)上是雙羧酸的酯，一個(gè)被四所酯化，另一個(gè)被葉醇基所酯化，故可以發(fā)生皂化反應(yīng)生成鈉鹽：C55H72MgN4O5+2NaOHC34H30O5N4MgNa2+CH3OH+C20H39OH在酸性介質(zhì)中，葉綠素鈉鹽分子中的鎂極易被氫原子取代生成褐色的葉綠素酸：C34H30O5N4MgNa2+4H+C34H34O5N4+Mg2++2Na+葉綠素酸可與銅鹽加熱條件下生成葉綠素銅酸析出，將葉綠素銅酸溶于丙酮，再與堿反應(yīng)就生成葉綠素銅鈉鹽：C34H34O5N4+Cu2+C34H34O5N4Cu+2H+C34H34O5N4Cu+2NaOHC34H34O5N4CuNa2+2H2O由葉綠素轉(zhuǎn)化成葉綠素銅鈉的過(guò)程也可用化學(xué)反應(yīng)方程表示：（1）皂化：COOCH3COONaC32H30ON4Mg+2NaOH→C32H30ON4Mg+CH3OH+C20H39OHCOOC20H39COONa（2）酸化：COONaCOOHC32H30ON4Mg+2H2SO4→C32H30ON4H2+MgSO4+NaSO4COONaCOOH（3）銅代：COOHCOOHC32H30ON4H2+CuSO4→C32H30ON4Cu+H2SO4COOHCOOH（4）成鹽：COOHCOONaC32H30ON4Cu+2NaOH→C32H30ON4Cu+2H2OCOOHCOONa三、實(shí)驗(yàn)儀器和試劑1.儀器：（一個(gè)），分液漏斗（2個(gè)）,250mL錐形瓶（1個(gè)），燒杯（100ml、250mL、500mL）各1個(gè)，容量瓶（100mL、250mL）各1個(gè)，蒸餾裝置，減壓過(guò)濾裝置，玻璃棒，電子天平，圓底燒瓶（250mL）2個(gè)，酸度計(jì)，分光光度儀（一臺(tái)）。2.試劑：（50g）、95%乙醇，丙酮，石油醚，2%～5%NaOH乙醇溶液，硫酸銅溶液，無(wú)水乙醇，稀鹽酸，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀。四、實(shí)驗(yàn)流程 蠶沙——預(yù)處理——浸提（三次，分別是3h,1h,1h）——抽濾——濃縮——萃取液皂化——分離——萃取——調(diào)PH值——銅化——抽濾——離析——沉淀——烘干——純化——成鹽——過(guò)濾——成品五、實(shí)驗(yàn)步驟葉綠素原料→極性有機(jī)溶劑萃取→過(guò)濾→萃取液→皂化→非極性有機(jī)溶劑萃取除去脂溶劑性質(zhì)→葉綠素鹽溶液→酸化形成葉綠素酸→→銅代→加氫氧化鈉形成葉綠素銅鈉→洗滌干燥→檢驗(yàn)純度及質(zhì)量。（1）蠶沙預(yù)先處理：將50g蠶沙放入打磨機(jī)中打磨粉碎。（2）從蠶沙中提取葉綠素：加入乙醇-丙酮混合液（1:1）150ml于40~45°C提取3~5h，抽濾，濾渣再用同等體積乙醇-丙酮的混合液提?。?）葉綠素的皂化：合并兩次提取液并加5%的NaOH-乙醇水溶液調(diào)pH值為11，水浴加熱(50-60°c)皂化回流1h左右。皂化目的是為了除去甲基和葉綠基酯基，即向溶液中加入NaOH溶液，在溫度為50-60°（4）回收，洗滌：皂化完畢后，蒸餾回收混合液（60°（5）葉綠素酸中的銅代：石油醚下層液用稀鹽酸溶液調(diào)pH值為7后，加入2-3mlCuSO4溶液，再用稀鹽酸將溶液調(diào)節(jié)pH值為2。在50°（6）洗滌：室溫下收集沉淀，先用50~60°（7）溶解成鹽：靜置4小時(shí)后，用抽濾瓶進(jìn)行抽濾，濾餅用丙酮溶解，再加入5%的NaOH-乙醇溶液pH值為12（相當(dāng)于100g葉綠素銅酸約加入20gNaOH），皂化回流1小時(shí)，成鹽（過(guò)程是先呈粘稠狀，隨著NaOH的加入,漸漸變稀,直到pH達(dá)到11時(shí)又復(fù)變稠），可用濾紙法檢驗(yàn)成鹽情況：用玻棒點(diǎn)少許溶液放在濾紙上，濾紙不顯綠色則說(shuō)明完全成鹽。（8）過(guò)濾干燥：靜置過(guò)濾，收集沉淀，用無(wú)水乙醇洗滌，然后在60°C~80°C下烘箱中烘干結(jié)晶物，粉碎即得葉綠素銅鈉鹽。稱量，計(jì)算產(chǎn)率。（9）純度分析：1、標(biāo)準(zhǔn)葉綠素銅鈉鹽的標(biāo)準(zhǔn)曲線：用電子天平稱取標(biāo)準(zhǔn)樣品0.0100g，加水溶解。轉(zhuǎn)入10mL容量瓶中定容，搖勻。準(zhǔn)確取1mL溶液以pH為7.5的磷酸鹽緩沖液定容為100mL，搖勻，即為0.001%溶液。用分光光度計(jì)測(cè)定，在15分鐘內(nèi)用1cm的比色杯，在405nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液的吸光值A(chǔ)（每隔10nm測(cè)定一次），以緩沖液作空白對(duì)照。類似地，配制0.0005%,0.00075%,0.001%，0.005%,0.0075%濃度的溶液，用分光光度計(jì)測(cè)定，在15分鐘內(nèi)用1cm的比色杯，在405nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液的吸光值A(chǔ)（每隔10nm測(cè)定一次），以緩沖液作空白對(duì)照，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2、標(biāo)準(zhǔn)葉綠素銅鈉鹽的吸收曲線：取1中配置好的0.001%的溶液，用分光光度計(jì)測(cè)定，在15分鐘內(nèi)用1cm的比色杯，在360nm～700nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液的吸光值A(chǔ)（每隔10nm測(cè)定一次），以緩沖液作空白對(duì)照。記錄數(shù)據(jù),并繪制吸收曲線。3、產(chǎn)品葉綠素銅鈉鹽的吸光比測(cè)定：稱取烘干成品0.100g（精確至0.0002g），加水溶解，移入10mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻。從容量瓶中準(zhǔn)確取2.00mL溶液移入50mL容量瓶，用pH=7.5磷酸鹽緩沖液定容至刻度，搖勻，即為0.004%溶液，此液最大吸收峰為405nm與630nm。以緩沖溶液為空白液，用分光光度計(jì)測(cè)定，在350nm-700nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液吸光值A(chǔ)（每隔5nm或10nm測(cè)定一次），記錄數(shù)據(jù)，繪制吸光曲線。六、注意事項(xiàng)：1.水浴加熱時(shí)溫度控制不宜加熱過(guò)快；2.減壓蒸餾時(shí)對(duì)壓力的要求不能過(guò)高；3.保證浸潤(rùn)時(shí)間足夠、提取完全；4.實(shí)驗(yàn)操作的規(guī)范及安全問(wèn)題；5.要調(diào)節(jié)好溶液中pH值大小；6.實(shí)驗(yàn)操作的規(guī)范及安全問(wèn)題。七、試驗(yàn)記錄表1實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象記錄試驗(yàn)操作試驗(yàn)現(xiàn)象備注稱取干燥粉碎的蠶沙50.00g蠶沙表面灰綠色，粗糙，呈六棱形，粉碎后變成粉末狀粉末中不能有過(guò)多的顆粒存在加入蒸餾水潤(rùn)濕，再加入95%乙醇，用磁力攪拌器再60度下加熱攪拌2h，抽濾，棄去濾渣，保存濾液得到墨綠色濾液和黑色濾渣使用雙層濾紙重復(fù)回流兩次抽濾，棄去濾渣，合并濾液得到墨綠色濾液和黑色濾渣使用雙層濾紙把濾液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，并在55-60℃加熱蒸餾回收95^%乙醇得到無(wú)色透明的回收乙醇和墨綠色濃縮液燒杯壁上沾喲墨綠色物質(zhì)在濃縮液5%NaOH-C2H5OH，調(diào)節(jié)PH=11-12,溫度為55℃，皂化時(shí)為3溶液的實(shí)際pH=11.35，且溶液中有小氣泡皂化過(guò)程皂化后用石油醚萃取雜質(zhì)，棄去上層液分層，上層黃綠色，下層綠色除雜除雜后的皂化液加HCl調(diào)，PH＝7加入10%CuSO4調(diào)PH＝2－3，在攪拌下溫度55℃，保持1h加HCl得pH＝7.05加入硫酸銅溶液pH=2.12，溶液中現(xiàn)膠狀墨色懸浮物銅代過(guò)程靜置過(guò)濾，收集沉淀，用無(wú)水乙醇洗滌，然后在60°C~80°C下烘箱中烘干結(jié)晶物，粉碎即得葉綠素銅鈉鹽。60℃烘干得0.9578g得墨綠色物質(zhì)洗滌液呈綠色去離子水呈綠色固體溶解得綠色液體得墨綠色粉末成鹽過(guò)程稱取0.100g葉綠素銅鈉溶于蒸餾水配成1%溶液，測(cè)其pH值溶液呈教亮的深綠色溶解后用PH=7.5的緩沖液定容表2標(biāo)準(zhǔn)樣品葉綠素銅鈉鹽吸收曲線的測(cè)定數(shù)據(jù)表波長(zhǎng)360370380390400405410吸光度0.2510.2520.2630.2820.3150.3240.326波長(zhǎng)420430440450460470480吸光度0.3010.2530.2130.1870.1660.1440.137波長(zhǎng)490500510520530540550吸光度0.1250.1170.1180.1120.1070.1010.104波長(zhǎng)560570580590600610620吸光度0.0970.1010.0930.0940.1040.0970.098波長(zhǎng)630640650660670680690吸光度0.1060.1130.1120.1120.1060.0920.083波長(zhǎng)700吸光度0.076表3葉綠素銅鈉鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定數(shù)據(jù)表（光波長(zhǎng)405nm）溶液百分?jǐn)?shù)（%）0.00050.2110.00100.3240.00150.4920.00200.574

附表一：標(biāo)準(zhǔn)葉綠素銅鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線附表二：產(chǎn)品葉綠素銅鈉吸收曲線產(chǎn)品葉綠素銅鈉產(chǎn)品葉綠素銅鈉吸收曲線y=181.5x+0.1202500.20.40.60.80.00050.0010.00150.002溶液百分含量吸光度A附表三:405nm波長(zhǎng)下葉綠素標(biāo)準(zhǔn)曲線八、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理（1）所得產(chǎn)品質(zhì)量m=0.實(shí)驗(yàn)用蠶沙質(zhì)量m=50.00g，故產(chǎn)率為：w=0.03g/50.00gx100%=0.06%（2）產(chǎn)品葉綠素銅鈉純度：當(dāng)A405nm=0.324,由標(biāo)準(zhǔn)曲線得溶液的百分量，即x=(0.324-0.12025)/181.5=0.1123%.產(chǎn)品純度：∩=0.1123%/0.06%=1.87（3）A405nm=0.324A630nm=0.034吸光比：A405nm/A630nm=0.324/0.034=9.53九、實(shí)驗(yàn)討論攪拌萃取的時(shí)間不足，浸提的時(shí)間不足，浸提不夠充分。皂化不夠充分，雖然皂化的時(shí)間比較長(zhǎng)，但效果還是不明顯，可能是由于皂化時(shí)PH值沒(méi)調(diào)節(jié)好以及溫度沒(méi)控制好。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸餾回收乙醇的時(shí)間不足，使得濃縮液中殘留過(guò)多的乙醇，把葉綠素溶解在其中，不利于后來(lái)對(duì)葉綠素的提取。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中加入各種試劑的量控制不是非常精確，調(diào)節(jié)PH也有偏差，使得提取的葉綠素存在較多的雜質(zhì)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中洗滌、過(guò)濾和轉(zhuǎn)移的次數(shù)比較多，使得產(chǎn)品損失較大。葉綠素結(jié)晶過(guò)程中，由于烘干不夠充分，導(dǎo)致晶體中水分較多，產(chǎn)品純度低。萃取前，應(yīng)取一些皂化液驗(yàn)證是否皂化完全，如果出現(xiàn)明顯分層現(xiàn)象，則說(shuō)明皂化完全，但我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中，雖然進(jìn)行了多次較長(zhǎng)時(shí)間的皂化，可還是無(wú)法出現(xiàn)明顯的分層，初步分析原因應(yīng)為皂化過(guò)程中PH值調(diào)節(jié)不好。本次實(shí)驗(yàn)測(cè)得的吸光度值與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的吸收曲線有偏差，原因可能有：（1）所制備的產(chǎn)品純度較低；（2）產(chǎn)品沒(méi)有完全烘干。十、實(shí)驗(yàn)心得與體會(huì)這一次實(shí)驗(yàn)在操作過(guò)程中出現(xiàn)了一些問(wèn)題，使得實(shí)驗(yàn)存在一些誤差，包括人為的操作失誤，偶然的誤差和系統(tǒng)誤差，表現(xiàn)為繪制出來(lái)的樣品葉綠素銅鈉鹽吸收曲線最大吸收峰與理論值有所偏差以及產(chǎn)品純度不高。通過(guò)這次實(shí)驗(yàn)，我對(duì)各種儀器的使用有了更進(jìn)一步的了解，對(duì)基本的實(shí)驗(yàn)操作也有了更深刻的認(rèn)識(shí)，學(xué)會(huì)了獨(dú)立思考和自己設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的能力，學(xué)會(huì)了怎樣設(shè)計(jì)和操作一個(gè)完整的實(shí)驗(yàn)。我在這次實(shí)驗(yàn)中收獲很大，使我受益匪淺。十一、參考文獻(xiàn)：[1]曾昭瓊．有機(jī)化學(xué)[M]．北京：高等教育出版社，1997564-565．[2]楊昆山．配位化學(xué)[M]．成都：四川大學(xué)出版社，1987．270-273．[3]楊繼生，何學(xué)志，揚(yáng)州大學(xué)化學(xué)化工系，葉綠素銅鈉鹽的性質(zhì)，制備工藝及應(yīng)用，廣州食品工業(yè)科技，2002-(1)-(27)[4]王正平，單旭峰，哈爾濱工程大學(xué)化工學(xué)院，葉綠素銅鈉的制備及穩(wěn)定