玉米葉片硝酸還原酶活性的研究

玉米葉片硝酸還原酶活性的研究

氮素是玉米生長發(fā)育所需物質(zhì)的主要來源，在玉米產(chǎn)量中起著重要作用。目前報(bào)道的測定植物葉片NR活性的方法主要有活體法1材料和方法1.1玉米自交系試驗(yàn)材料取自陜西省楊凌示范區(qū)西北農(nóng)林科技大學(xué)西卜村新品種示范園中進(jìn)行田間試驗(yàn)的玉米自交系許178。于2015年7月20日,在玉米吐絲后一周時(shí)取長勢均勻一致的植株穗位葉葉片,迅速放入液氮中冷凍,帶回實(shí)驗(yàn)室放入-80℃冰箱保存,用于NR活性的測定。1.2處理因素和設(shè)計(jì)參考《植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》1.2.1研磨nr活性參考文獻(xiàn)[15]給出的研磨方法是把植物葉片放在研缽里面,加入少量石英砂和緩沖液后手動(dòng)研磨。作者在采用此方法測定NR活性的時(shí)候發(fā)現(xiàn)該方法研磨速度較慢,大批量測定時(shí)影響試驗(yàn)效率。因此,為了提高研磨速度,設(shè)置了一個(gè)液氮研磨的處理,旨在探討不同研磨方法是否對NR活性測定有所影響。1.2.2不同nadh用量對nr活性的測定無梯度對活性的測定不影響小在標(biāo)準(zhǔn)方法加入0.30mLNADH的基礎(chǔ)上,另外設(shè)置了0.45、0.15、0.10mL幾個(gè)梯度,目的在于了解NADH用量對NR活性測定的影響。1.2.3ph對nr活性的影響酶的活性不僅受到溫度的影響,還受到其他因素的影響,pH就是其中的1個(gè)重要因素,本試驗(yàn)設(shè)置了7.0、7.5、8.03個(gè)pH梯度,以確定玉米NR還原反應(yīng)的最適pH。1.2.4反應(yīng)溫度的確定反應(yīng)溫度是最重要的影響因素,本試驗(yàn)設(shè)置了20、25、30、35、40℃5個(gè)酶活反應(yīng)溫度梯度,目的在于確定玉米NR還原反應(yīng)的最適溫度。1.2.5反應(yīng)時(shí)間對nr活性的影響在標(biāo)準(zhǔn)方法給出的反應(yīng)時(shí)間30min基礎(chǔ)上,另外設(shè)置了40、20、10、5min的反應(yīng)時(shí)間,目的在于確定縮短反應(yīng)時(shí)間是否會(huì)影響玉米NR活性的測定。1.2.6酶活顯色時(shí)間梯度設(shè)計(jì)在標(biāo)準(zhǔn)方法給出的顯色時(shí)間15min基礎(chǔ)上,另外設(shè)置了5、10、20、25min4個(gè)酶活顯色時(shí)間梯度,目的在于確定最佳的顯色時(shí)間。1.2.7統(tǒng)計(jì)分析方法NR活性測定采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法,從標(biāo)準(zhǔn)曲線中檢出NO式中,C用MicrosoftExcel2003和SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2結(jié)果與分析2.1研磨法測nr活性選用了液氮研磨法和石英砂研磨法2種方法,結(jié)果如圖1所示。盡管采用液氮研磨法速度較快,可以提高試驗(yàn)效率,但是測得的NR活性比石英砂法顯著降低。因此,為了保證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性,采用石英砂研磨法。2.2原劑nadh量對nr活性的影響不同的樣品,其NR活性不同,對于不同的樣品質(zhì)量,NR的活性也是不同的2.3過酸及過堿法pH是影響酶活性的重要因素之一,只有在特定的pH條件下,酶才能夠表現(xiàn)出最大的活性。過酸或過堿不僅會(huì)降低酶的活性,有時(shí)甚至?xí)姑傅幕钚詥适?。由圖3可知,pH7.5時(shí)NR的活性最大,說明其最適pH為7.5,且與pH為7.0、8.0相比,差異達(dá)到顯著水平。2.4反應(yīng)溫度對酶活性的影響在一定條件下,每種酶都有其最適反應(yīng)溫度,低于或高于其最適反應(yīng)溫度都會(huì)降低酶的活性。同時(shí),對于相同的酶,不同的植物可能其最適反應(yīng)溫度也有不同?！吨参锷韺W(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》2.5反應(yīng)時(shí)間及時(shí)間對nr活性的影響從圖5可以看出,反應(yīng)時(shí)間為20、10min時(shí)測得NR的活性與30min時(shí)測得的酶活性無顯著差異,反應(yīng)時(shí)間為5、40min時(shí)測得的NR活性與30min測得的NR活性差異顯著。因此為了快速準(zhǔn)確地測定酶的活性,10min是較好的反應(yīng)時(shí)間。2.6不同時(shí)間點(diǎn)的nr活性由圖6可知,5min的顯色時(shí)間與其他4個(gè)時(shí)間測定的NR活性差異顯著,而其他4個(gè)時(shí)間點(diǎn)測定的NR活性差異不顯著。因此為了節(jié)約時(shí)間,提高測定效率,可以把顯色時(shí)間縮短至10min。3討論3.1最佳研磨法的溫度對nr活性的影響本試驗(yàn)結(jié)果表明,石英砂研磨法比液氮研磨法對NR活性的測定更為合適,原因可能是液氮的超低溫對葉片中的NR活性產(chǎn)生影響。在超低溫下,酶的活性可能會(huì)徹底喪失,或酶在超低溫下活性降低后難以恢復(fù),從而影響酶活性的測定。與液氮研磨法相比,石英砂研磨法的溫度適中,酶活性損失較少。因此對于硝酸還原酶活性的測定,石英砂研磨法是較好的選擇。3.2不同nadh用量對玉米穗位葉nr活性的影響NADH作為生物體中提供還原力的一種物質(zhì),對植物的生命活動(dòng)影響重大,是必不可少的。在NR的測定過程中,NADH的用量對酶活性的測定也具有影響。因此,本試驗(yàn)針對其用量進(jìn)行了探討。本試驗(yàn)結(jié)果表明,NADH的用量由0.30mL增加至0.45mL,對結(jié)果無影響,減少其用量至0.15mL時(shí),對酶活性的測定影響較小,但當(dāng)加入量為0.10mL時(shí),測得的酶活性顯著降低。原因可能是在一定的提取液中,對酶的提取量是一定的。對于玉米穗位葉NR活性的測定,0.15mL的NADH是足夠的,因此增加NADH加入量對酶活性的測定沒有顯著差異;但當(dāng)?shù)陀?.15mL時(shí),由于還原力不夠,酶活性顯著降低。因此,為節(jié)省成本,可以在不影響試驗(yàn)結(jié)果的同時(shí)適當(dāng)減少NADH用量。3.3最適溫度為35，最適ph值為7.5試驗(yàn)結(jié)果表明,玉米NR活性測定的最適還原溫度是35℃,低于或高于這個(gè)溫度都不能很好地測定NR的活性。同時(shí)發(fā)現(xiàn)與Averina等3.4不同反應(yīng)時(shí)間對nr活性的影響在酶活性測定過程中,顯色時(shí)間和反應(yīng)時(shí)間對酶活性的測定也具有一定的影響。顯色時(shí)間過短,亞硝酸鹽與磺胺及萘胺的反應(yīng)不能充分進(jìn)行,得出的酶活性偏低;顯色時(shí)間過長,則浪費(fèi)了許多時(shí)間,試驗(yàn)效率低。同時(shí)也發(fā)現(xiàn),反應(yīng)時(shí)間的長短也會(huì)對酶活性的測定產(chǎn)生影響,反應(yīng)時(shí)間過短,反應(yīng)不能充分進(jìn)行,測得的酶活性低;反應(yīng)時(shí)間過長,也會(huì)使測得的酶活性降低。因此在本次試驗(yàn)中,對反應(yīng)時(shí)間和顯色時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化設(shè)計(jì)。試驗(yàn)中共設(shè)了5個(gè)顯色時(shí)間梯度進(jìn)行研究探討,結(jié)果表明,將顯色時(shí)間降低到10min對NR活性的測定結(jié)果無顯著影響;但當(dāng)顯色時(shí)間降低到5min時(shí),酶活性顯著降低,其原因可能是時(shí)間太短,反應(yīng)還未充分進(jìn)行,說明亞硝酸鹽與磺胺及萘胺的反應(yīng)可能在5~10min已反應(yīng)完全,之后反應(yīng)液的顏色不會(huì)發(fā)生顯著變化,即反應(yīng)液的吸光度也沒有顯著變化。因此,為了節(jié)省時(shí)間,可以將顯色時(shí)間縮短到10min。同時(shí)對反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化,當(dāng)縮短至20min和10min時(shí)對酶活性的測定結(jié)果沒有影響,與Férrario-Mery等4反應(yīng)條件的確定分別對硝酸還原酶活性測定過