小麥葉片葉綠素含量測定方法比較

小麥葉片葉綠素含量測定方法比較

材料和方法1.1mm培養(yǎng)餅、可以打濕取事先準備的小麥種子，用自來水沖洗，表面的灰塵和雜質(zhì)。用自來水沖洗120mm培養(yǎng)池，干燥，放置2.3ml濾紙，用水濕潤。將備用的小麥種子平鋪在濾紙上，放入4～5個培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，放到陽光充足、溫度適宜的地方進行培養(yǎng)，隔3～4h澆1次水。觀察小麥生長情況，待小麥苗長至5cm時移到花盆中進行后續(xù)生長，待小麥葉片蔥綠，高度約10cm時準備進行試驗。1.2測試方法1.2.1葉綠素含量測定取新鮮干凈小麥葉片，稱量0.4g于研缽中剪碎，加入少許石英砂和碳酸鈣粉及4～6mL95%乙醇，研磨成勻漿，繼續(xù)加入95%乙醇研磨至組織變?yōu)榘咨o置一段時間，取1張干凈濾紙放于漏斗內(nèi)壁，用乙醇潤濕，玻璃棒置于濾紙3層處，把勻漿沿玻璃棒引流，過濾到50mL棕色容量瓶中，用乙醇洗研缽及玻璃棒，一并轉(zhuǎn)入，最后用95%乙醇定容至50mL,重復(fù)2次。取潔凈比色皿(用手拿住比色皿的糙面),先用少量待測液清洗2～3次，然后將溶液倒入比色皿中(高度不得超過比色皿總高的4/5),將灑出的溶液用濾紙吸掉，第1個比色皿中放95%乙醇溶液為空白對照。然后測定其在波長663nm和645nm處的吸光度。每個重復(fù)在不同波長下測3次，取平均值。通過以下公式計算葉綠素含量。葉綠素a含量葉綠素b含量葉綠素總量式中：1.2.2研缽加90%乙醇法取新鮮干凈小麥葉片，稱取0.5g于研缽中剪碎，加入少許石英砂和碳酸鈣粉及3mL95%乙醇，研磨成勻漿，再加95%乙醇3～5mL,靜置一段時間，將勻漿轉(zhuǎn)入10mL離心管中，并用適量95%乙醇洗滌研缽，一并轉(zhuǎn)入，然后以4000r/min離心10min后，棄沉淀，上清液用95%乙醇定容至10mL,重復(fù)2次。取上述色素提取液2mL,加95%乙醇16mL稀釋得到待測液；測定與計算方法同“1.2.1”節(jié)。1.2.3小麥葉片的提取稱取新鮮干凈小麥葉片0.02g,將其剪成長度約5mm、寬度約1mm的細絲。將準備好的細絲等量分別放入3支試管中(試管用黑塑料袋包裹),滴加10mL無水乙醇，室溫下暗處浸泡提取3d左右，期間加以搖晃可縮短浸泡時間，至小麥葉片無色或白色。將提取液再次定容至10mL;測定與計算方法同“1.2.1”節(jié)，其中空白對照為無水乙醇。1.2.480%乙醇提取物法步驟同“1.2.3”節(jié)，只需用80%乙醇溶液替代無水乙醇即可。1.2.5掃描數(shù)據(jù)的處理手持CM-1000葉綠素測量儀，距離小麥葉片30.5～183.0cm,打開開關(guān)，即可進行掃描，等數(shù)據(jù)出現(xiàn)后進行記錄，間隔2s就可以進行下一次測量，重復(fù)3次取平均值。1.2.6小麥葉綠素的提取鎂標準曲線的繪制：將配制好的1.000mg/mL鎂儲備液稀釋至10.00μg/mL,得到鎂標準溶液。移此溶液0、0.5、1.5、2.5、3.5、5.0mL于6個50mL的容量瓶中，再分別滴加20mL0.8mol/mLHCl溶液，用蒸餾水定容。得濃度分別為0、0.1、0.3、0.5、0.7、1.0μg/mL標準液，以濃度為0的溶液作為空白對照，測定標準液在285nm處的吸光度，分別為0.015、0.116、0.245、0.418、0.552、0.743,繪制出標準曲線，線性函數(shù)為取新鮮干凈小麥葉片，稱取約2.0g剪碎，加入少許石英砂和碳酸鈣粉及4～6mL無水乙醇，研磨成勻漿，繼續(xù)加入無水乙醇研磨至組織變?yōu)榘咨?，靜置一段時間，取1張干凈濾紙放于漏斗內(nèi)壁，用乙醇潤濕，玻璃棒置于濾紙3層處，把勻漿沿玻璃棒引流，過濾到50mL棕色容量瓶中，用乙醇洗研缽及玻璃棒，一并轉(zhuǎn)入，最后用無水乙醇定容至50mL,重復(fù)2次。得到小麥葉綠素提取液，置于避光處備用。取上述葉綠素提取液4.0mL于分液漏斗中，滴加4.0mL石油醚，輕輕搖動；再加4.0mLNaCl溶液，上下振蕩；再加入12.0mL蒸餾水，充分振蕩以后靜置分層，深綠色的石油醚層在上層，水-乙醇層在下層。從下面倒出水-乙醇層，再用4.0mL石油醚重復(fù)萃取2次，然后合并3次所得到的石油醚相。于其中加入20mL0.8mol/L的HCl溶液，充分振蕩后放置分層，將水相轉(zhuǎn)移到50mL容量瓶中，用蒸餾水定容，得到待測液。采用火焰原子吸收分光光度計361MC測定待測夜中鎂元素的吸光度。通過以下公式計算葉綠素含量：葉綠素總量式中：C為待測液中的鎂濃度(小麥葉片葉綠素含量的測定結(jié)果由表1可見，95%乙醇研磨-過濾法所測得的葉綠素含量高于95%乙醇研磨-離心法；無水乙醇浸提法所測得的葉綠素含量高于80%乙醇浸提法；浸提法所測得的葉綠素含量均高于研磨法；葉綠素儀法無法測出葉綠素a、葉綠素b含量。原子吸收光譜法測得的葉綠素總量為(4.025±0.110)mg/g,其所測得的葉綠素總量最高，且標準差也最小，所以此方法所測結(jié)果最準確，但缺點是無法測出葉綠素a、葉綠素b的含量。小麥葉片在經(jīng)過95%乙醇溶液研磨之后，過濾法與離心法測得的葉綠素含量有明顯差異。過濾法所測得的含量高于離心法，說明在離心的過程中，勻漿從研缽轉(zhuǎn)移到離心管以及葉綠素提取液從離心管轉(zhuǎn)移到試管的過程中，小麥葉綠素遭到光、氧的損傷，同時還存在溶液灑出的情況，導(dǎo)致離心法測得的含量偏低；而在過濾的過程中，并沒有頻繁的轉(zhuǎn)移過程，直接過濾定容到容量瓶即可，可避免葉綠素的損失。乙醇作為提取劑來浸泡小麥葉片，不同濃度乙醇處理測得的葉綠素含量不同，可知提取劑濃度會影響葉綠素含量的測定。在相同條件之下，采用無水乙醇浸泡比80%乙醇浸泡測定效果更好，說明乙醇濃度越低其含水量越高，葉綠素在其提取劑中的溶解度降低，所以測得的葉綠素含量降低。浸提法測得的數(shù)據(jù)均比研磨法高，說明浸提法對小麥葉片的損害較少。在研磨過程中，研磨時間過長使葉綠素受到光解，且過程比較繁瑣，既要進行研磨，還有后續(xù)的過濾或離心處理，葉綠素含量會發(fā)生一定的減少。而浸提法只需將小麥葉片剪成細絲狀就可以直接放入浸提液中反復(fù)浸泡，至葉絲變白或無色即可，過程較簡單，且所測含量也較高。葉綠素儀法測得的結(jié)果是最低的，因為在測量過程中，CM-1000葉綠素儀所要求的待測植物的面積直徑最低應(yīng)為1.35cm,而試驗中所采用的小麥葉片由于生長時間較短，寬度僅為0.2～0.4cm;又因為使用葉綠素儀測定時，小麥葉片呈現(xiàn)一定程度的發(fā)黃現(xiàn)象，導(dǎo)致最終結(jié)果偏低。說明此方法無法測出準確數(shù)據(jù)，但是它的整個試驗過程極其簡單，對待測樣品也沒有嚴格的處理要求，只需保持一定的距離進行掃描即可得出葉綠素含量。原子吸收光譜法所測得的葉綠素總量為4.025mg/g,為6種方法中測得含量的最高值，且準確性也是最可靠的，因為通過間接測定葉綠素中鎂元素的濃度進而測定葉綠素含量，在其過程中可以減少葉綠素的降解和損失問題。但試驗過程中也存在一些誤差，比如葉綠素提取液的制備采用的是研磨法，存在一定程度的光解。但是與其他方法相比，此方法所用的火焰原子吸收光光度計能夠靈敏可靠地測定鎂元素的吸光度，所以其準確性仍是最高，誤差也最小。小麥葉綠素的測定方法在測定小麥葉綠素含量的6種方法中，原子吸收光譜法雖不是直接測定葉綠素含量的方法，但是其測定過程是對葉綠素中鎂元素進行直接測定，測定鎂元素的吸光度與直接測定葉綠素吸光度相比，其操作過程不存在葉綠素的降解，所以它的測定結(jié)果是最可靠、最準確的。無水乙醇浸提法所得結(jié)果較準確但時間最長；葉綠素儀法是粗略估計但時間最短；研磨法是傳統(tǒng)方法且一直沿用至今，但是過程繁瑣，需耗時耗力。另外，浸提法、研磨法以及原子吸收光譜法都是對待測樣品進行離體檢測，在此過程中也存在對待測樣品不同程度的損傷，而葉綠素儀法則是活體檢測，無需采摘；同時葉綠素儀法和原子吸收光譜法只能測出小麥的葉綠素總量，無法測出葉綠素a、葉綠素b含量。葉綠素含量是所有植物十分重要的生理指標之一在研磨-過濾和研磨-離心2種方法的操作過程中，考慮到過濾法比較耗時和乙醇揮發(fā)較快的原因，所以同時做了離心試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，離心所測的含量比過濾法還要低。但總體來講，研磨法與其他方法相比，表現(xiàn)為步驟瑣碎、工作量大、在研磨過程中對小麥葉片易有損傷且很容易受光氧化分解，并且無法防止試驗者不與揮發(fā)到四周空氣中的藥品接觸，對身體有較大的傷害用浸提法來進行小麥葉綠素含量測定時，使用了2種不同濃度的同一種提取劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高濃度組所測的含量比較高且準確。但這并不能說明提取劑濃度與所測葉綠素含量表現(xiàn)為正相關(guān)關(guān)系，如果未來有機會，將會使用乙醇作為單一提取劑，作梯度濃度試驗，以確定最佳乙醇濃度。同時本試驗與洪法水等的丙酮乙醇混合液作為浸泡液的試驗EYELHCM-1000葉綠素儀法作為一種測定植物相對葉綠素含量極其簡便的方法，由于結(jié)果不準確，故參考價值不大。但是此方法卻很簡單易測，并且儀器也很方便攜帶，