創(chuàng)傷感染細(xì)菌的分離鑒定課件

實驗三 創(chuàng)傷感染細(xì)菌、性傳播細(xì)菌的分離鑒定、病案討論一、討論：1、臨床樣本中致病性球菌的分離鑒定方案2、創(chuàng)傷感染細(xì)菌、性傳播細(xì)菌致病物質(zhì)及所致疾病二、示教：1、創(chuàng)傷感染細(xì)菌的分離鑒定、性傳播細(xì)菌形態(tài)與染色

2、創(chuàng)傷感染細(xì)菌培養(yǎng)物觀察(菌落的顏色、溶血性等）3、葡萄球菌血漿凝固酶試驗（試管法）三、操作：1、葡萄球菌血漿凝固酶試驗（玻片法）2、ASO 試驗3、RPR一、討論：1、臨床樣本中致病性球菌的分離鑒定方案機(jī)械學(xué)院王斌同學(xué)皮膚表面有一化膿感染病灶，經(jīng)久不愈。請設(shè)計一個方案：從膿汁標(biāo)本中分離、鑒定化膿性病原菌，并提出防治原則以實驗小組為單位先查文獻(xiàn)寫設(shè)計性方案上課每組派代表介紹自己小組的方案，其他組同學(xué)質(zhì)疑課堂討論完善，寫到實驗報告上生化模式轉(zhuǎn)變?yōu)閿?shù)學(xué)模式自動微生物鑒定和藥敏分析系統(tǒng)16SrRNA序列分析生物芯片技術(shù)特點金黃色葡萄球菌表皮葡萄球菌色素金黃色白色溶血素＋－/＋血漿凝固酶＋—發(fā)酵甘露醇＋—SPA＋—致病性強(qiáng)條件致病致病葡萄球菌鑒別鏈球菌鑒別

菌落小、半透明 、表面光滑、邊緣整齊

G+

、鏈狀完全溶血不溶血乙型鏈球菌丙型鏈球菌草綠色不完全溶血環(huán)菊糖發(fā)酵試驗?zāi)懼芫囼?（紫色）-（混濁）+（黃色）+（澄清）甲型鏈球菌肺炎鏈球菌一、討論：2、創(chuàng)傷感染細(xì)菌、性傳播細(xì)菌致病性致病物質(zhì)致病作用與所致疾病1．毒素1）葡萄球菌溶素

staphylolysin毒素性疾病，損傷細(xì)胞膜2）殺白細(xì)胞素

leukocidin損傷粒細(xì)胞、吞噬細(xì)胞細(xì)胞膜3）腸毒素enterotoxin食物中毒，假膜性腸炎4）

表皮剝脫毒素

exfoliatin燙傷樣皮膚綜合征5）毒性休克綜合征毒素—1

TSST-1毒性休克綜合征，發(fā)熱、多器官系統(tǒng)的功能紊亂2．酶1）

凝固酶

Coagulase侵襲性疾病，抗吞噬局限化及形成血栓2）其他酶透明質(zhì)酸酶（擴(kuò)散因子）降解結(jié)締組織的透明質(zhì)酸葡激酶（纖維蛋白溶酶）水解纖維素脂酶分解脂肪耐熱核酸酶DNA酶水解DNA，測定葡萄球菌有無致病性的重要指標(biāo)觸酶分解H2O2（二）鏈球菌致病物質(zhì)致病作用與所致疾病致熱外毒素Pyrogenic

exotoxin,

SPE鏈球菌溶素Streptolysin透明質(zhì)酸酶Hyaluronidase鏈激酶Streptokinase鏈道酶StreptodornaseM蛋白Protein

MF蛋白Protein

F猩紅熱（scarlet

fever）SLO 輔助診斷指標(biāo)

侵襲性疾病SLS

β溶血環(huán)擴(kuò)散因子，分解細(xì)胞間質(zhì)透明質(zhì)酸有利于化膿感染病灶擴(kuò)散水解纖維蛋白酶解核酸，膿稀薄汁有利于感染擴(kuò)散抗吞噬，抗吞噬細(xì)胞內(nèi)殺菌作用，超敏反應(yīng)，風(fēng)濕熱、感染后腎小球腎炎黏附素，利于宿主內(nèi)定植和繁殖脂磷壁酸LPA二、示教：1、創(chuàng)傷感染細(xì)菌、性傳播細(xì)菌形態(tài)與染色觀察2、創(chuàng)傷感染細(xì)菌、性傳播細(xì)菌培養(yǎng)物觀察(菌落的顏色、溶血性等）3、葡萄球菌血漿凝固酶試驗（試管法）staphylococcusStreptococcusG+，粗大桿菌，芽孢橢圓，位于菌體次極端，無鞭毛在體內(nèi)時有明顯莢膜有A-E 5個血清型產(chǎn)氣莢膜桿菌的形態(tài)、染色鉤端螺旋體、梅毒螺旋體鍍銀染色鉤端螺旋體（暗視野顯微鏡）鍍銀染色法（梅毒螺旋體）梅毒螺旋體（暗視野顯微鏡）鍍銀染色法（鉤端螺旋體）金黃色葡萄球菌血平板上遷徙生長，β溶血專性厭氧，生化反應(yīng)不活潑，繁殖體對青霉素敏感破傷風(fēng)桿菌的培養(yǎng)血平板上形成雙層溶血環(huán)在蛋黃瓊脂平板上，菌落出現(xiàn)乳白色渾濁圈（Nagler反應(yīng)）能發(fā)酵多種糖類，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，牛乳糖培養(yǎng)基中洶涌發(fā)酵產(chǎn)氣莢膜桿菌的培養(yǎng)Neisseria

gonorrhoeae0.8μm,

Gram

negative,

diplococci

(pairs

of

cocci)most

in

neutrophil

cells試管法檢測：

游離血漿凝固酶玻片法檢測：

結(jié)合血漿凝固酶三、操作：1、葡萄球菌血漿凝固酶試驗（玻片法）2、ASO

試驗3、RPR1、葡萄球菌血漿凝固酶試驗（玻片法）（1）原理：病原性葡萄球菌產(chǎn)生血漿凝固酶，可使含有枸櫞酸鈉或肝素抗凝劑的兔或人血漿發(fā)生凝固，故凝固酶可作為鑒別葡萄球菌有無致病性的重要指標(biāo)之一(2)材料兔血漿，金黃色葡萄球菌及白色葡萄球菌瓊脂斜面24小時培養(yǎng)物各一支。其它：生理鹽水、載玻片、試管、吸管等。生理鹽水生理鹽水金黃色葡萄球菌血漿表皮葡萄球菌血漿（3）方法與結(jié)果：玻片法一分鐘內(nèi)觀察結(jié)果，若細(xì)菌凝集成顆粒狀為血漿凝固酶陽性。鏈球菌溶素(streptolysin)對氧穩(wěn)定的鏈球菌溶素S（streptolysin

S）:β溶血對氧敏感的鏈球菌溶素O（streptolysin

O）：免疫原性強(qiáng)用于風(fēng)濕熱或腎小球腎炎的輔助診斷2、 抗O試驗（ASO

test）（1）ASO試驗原理中和實驗：被檢測血清+標(biāo)準(zhǔn)溶血素“O”25結(jié)合單位／毫升間接凝集實驗：①抗鏈球菌溶血素“O”(AsO)膠乳試劑：羧化聚苯乙烯乳膠與純化溶血素“O”用碳化二亞胺交聯(lián)，②被檢測血清中的ASO與ASO膠乳試劑反應(yīng)時，根據(jù)間接乳膠凝集試驗的原理，可引起乳膠顆粒的聚集。明顯凝集無凝集陽性陰性ASO試驗原理與方法：待檢測血清以及陽性和陰性對照血清溶血素“O”免疫微球溶血素“O”免疫微球8分鐘1分鐘（4）結(jié)果判斷：有明顯疑集者為陽性，無凝集者為陰性。病人血清1：50稀釋陽性反應(yīng)，相當(dāng)于傳統(tǒng)的溶血

試驗ASO

500單位，此時應(yīng)將病人血清作l：80～1：100稀釋，重復(fù)上述試驗，若仍為陽性，則病人血

清的ASO相應(yīng)為≥800單位～≥1000單位。操作三、 RPR實驗原理、步驟RPR試驗是非梅毒螺旋體抗原血清反應(yīng)的一種基本原理為間接凝集實驗+交叉反應(yīng)。該試驗是梅毒螺旋體感染人體后產(chǎn)生非特異抗心脂質(zhì)抗體，可用結(jié)合在碳末或甲基胺紅等顆粒上牛心脂質(zhì)（交叉抗原）檢測出待檢血清待檢血清RPR試劑RPR試劑臨床細(xì)菌學(xué)討論患者陳新，男性，5歲，經(jīng)常有咽炎，在三周前又急性發(fā)作，當(dāng)時進(jìn)行咽拭子細(xì)菌分離培養(yǎng)，于血平板上出現(xiàn)多數(shù)針帽大小的菌落，灰白色，于菌落周圍有透明的溶血環(huán)。涂片染色為革蘭氏陽性球菌，多呈短鏈狀排列，偶見成雙，現(xiàn)該病孩的主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱，食欲減退眼瞼浮腫，下肢用指頭壓迫，留下凹窩，尿量少，呈洗魚水色，體檢血壓，收縮壓

150mmHg

，舒張壓mmHg。小便：中段尿細(xì)菌檢查未見有菌生長，小便鏡檢有大量紅細(xì)胞及白細(xì)胞。蛋白陽性。1、病孩