三細(xì)胞生物學(xué)研究方法2

2023/9/21第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法

第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法

第二節(jié)細(xì)胞及其組分的分析方法第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞工程

第四節(jié)

細(xì)胞及生物大分子的動(dòng)態(tài)變化第五節(jié)模式生物與功能基因組的研究第1頁/共35頁2023/9/22第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法工欲善其事，必先利其器。顯微鏡之于生物學(xué)，猶如望遠(yuǎn)鏡之于天文學(xué)。第2頁/共35頁2023/9/231.1光學(xué)顯微鏡提高分辨率的手段有縮短光線波長，應(yīng)用特殊的光學(xué)效應(yīng)，增強(qiáng)反差。最短的可見光波長是450nm，此時(shí)分辨率約為0.3um，若在油鏡下，N可提高到1.5，分辨率可達(dá)到0.2um。這個(gè)數(shù)值就是顯微水平和亞顯微水平的分界線。第3頁/共35頁兩束光波之間的相互干涉2023/9/24第4頁/共35頁2023/9/25不同顯微鏡下觀察體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞A、普通光學(xué)顯微鏡B、相差顯微鏡C、微分干涉顯微鏡增強(qiáng)樣品的反差，實(shí)現(xiàn)了對非染色活細(xì)胞的觀察第5頁/共35頁2023/9/26熒光顯微鏡技術(shù)細(xì)胞中有些物質(zhì)，如葉綠素等，受紫外線照射后可發(fā)熒光；另有一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經(jīng)紫外線照射亦可發(fā)熒光，熒光顯微鏡就是對這類物質(zhì)進(jìn)行定性和定量研究的工具之一。目前，熒光顯微鏡得到了廣泛的應(yīng)用，特別是細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)的研究。第6頁/共35頁2023/9/27熒光蛋白日本科學(xué)家下村修、美國科學(xué)家馬丁·沙爾菲和美籍華裔科學(xué)家錢永健獲得2008年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。下村修是首位從水母中分離綠色熒光蛋白的科學(xué)家，他發(fā)現(xiàn)這種蛋白在紫外線光中呈現(xiàn)亮色。馬丁-查爾菲展示了綠色熒光蛋白作為各種生物現(xiàn)象的亮光基因標(biāo)簽的價(jià)值。錢永健對我們理解綠色熒光蛋白如何發(fā)光作出了貢獻(xiàn)，他還將顏色標(biāo)簽擴(kuò)展至除綠色之外的顏色，以便可以用各種顏色標(biāo)識(shí)不同的蛋白和細(xì)胞。第7頁/共35頁2023/9/281.2電子顯微鏡電鏡采用波長比可見光短得多的電子束作為光源。電子束的波長只有0.01-0.9nm，分辨率可達(dá)0.2nm，是光鏡的1000倍。電鏡和光鏡在基本原理上完全不同，但光路圖十分相近。染色方法不同，光鏡用染料，而電鏡用重金屬鹽，所以電鏡不能觀察活的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。缺點(diǎn)：不能觀察活的生物樣品第8頁/共35頁2023/9/29第9頁/共35頁2023/9/210電鏡與光鏡比較顯微鏡分辨本領(lǐng)光源透鏡真空成像原理LMTEM200nm0.2nm可見光（400-700）電子束（0.01-0.9）玻璃透鏡電磁透鏡不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用樣品對光的吸收形成明暗反差和顏色變化利用樣品對電子的散射和透射形成明暗反差，圖像需要用熒光屏顯示或者感光膠片作記錄。第10頁/共35頁2023/9/211電鏡超薄樣本制備示意圖第11頁/共35頁冷凍蝕刻技術(shù)冷凍斷裂和蝕刻復(fù)型不需要包埋和固定2023/9/212第12頁/共35頁掃描電鏡技術(shù)電子探針激發(fā)樣品表面（噴鍍金膜）放出二次電子，轉(zhuǎn)變成光信號，得到樣品表面的立體圖像信息。2023/9/213第13頁/共35頁2023/9/214高爾基體透射電鏡圖（偽彩色）既然有了電子顯微鏡，還需要光學(xué)顯微鏡嗎？？第14頁/共35頁2023/9/2151.3掃描隧道顯微鏡根據(jù)隧道效應(yīng)而設(shè)計(jì)，是一種探測微觀世界物質(zhì)表面形貌的儀器。分辨率能達(dá)到0.1nm(原子尺度)，非破壞性測量，納米生物學(xué)。1986年諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)?lì)愃频倪€有原子力顯微鏡第15頁/共35頁小結(jié)光鏡、分辨率光鏡的發(fā)展：相差顯微鏡、熒光顯微鏡電鏡：原理、制片、掃描電鏡、冷凍蝕刻技術(shù)掃描隧道顯微鏡2023/9/216第16頁/共35頁單詞electronmicroscope,fluorescencemicroscope.2023/9/217第17頁/共35頁2023/9/218第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法

第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法

第二節(jié)細(xì)胞及其組分的分析方法第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞工程

第四節(jié)

細(xì)胞及生物大分子的動(dòng)態(tài)變化第五節(jié)模式生物與功能基因組的研究第18頁/共35頁2023/9/219細(xì)胞組分的分離

差速離心：在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級離心，用于分離不同大小的細(xì)胞和細(xì)胞器第19頁/共35頁2023/9/220密度梯度離心用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場的作用使細(xì)胞分層、分離。第20頁/共35頁2023/9/221細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、糖和脂類的顯示方法原理：利用一些顯色劑與所檢測物質(zhì)中一些特殊基團(tuán)特異性結(jié)合的特征，通過顯色劑在細(xì)胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質(zhì)在細(xì)胞中的分布和含量。第21頁/共35頁2023/9/2221.金屬沉淀法：利用金屬化合物在反應(yīng)過程中生成有色沉淀2.偶氮偶聯(lián)法：酚類化合物與偶氮染料結(jié)合后可以形成耐曬染料。3.Schiff反應(yīng)：細(xì)胞中的醛基可使Schiff試劑中的無色品紅變?yōu)榧t色。通常用于顯示糖和脫氧核糖核酸（Feulgen反應(yīng)）。4.聯(lián)苯胺反應(yīng)5.普魯士藍(lán)反應(yīng)：三價(jià)鐵與酸性亞鐵氰化鉀作用，形成普魯士藍(lán)。6.Formazane反應(yīng)：顯示脫氫酶。7.“Nadi”反應(yīng)：顯示細(xì)胞色素氧化酶。8.脂溶染色法：借蘇丹染料溶于脂類而使脂類顯色。9.茚三酮反應(yīng)：顯示蛋白質(zhì)。第22頁/共35頁2023/9/223特異蛋白和特異核酸的定性和定位特異蛋白抗原的定位與定性

主要是免疫反應(yīng)特異核酸的定位與定性

分子雜交技術(shù)熒光顯微鏡電子顯微鏡第23頁/共35頁2023/9/224利用免疫反應(yīng)對特異蛋白抗原的定位與定性免疫電鏡技術(shù)免疫熒光技術(shù)第24頁/共35頁2023/9/225放射自顯影技術(shù)研究生物大分子的合成動(dòng)態(tài)

原理及應(yīng)用：

利用放射性同位素的電離輻射對乳膠（含鹵化銀）的感光作用，對細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行定性、定位與半定量研究；特征是可以實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行動(dòng)態(tài)和追蹤研究。操作：見書P68和圖3-22第25頁/共35頁2023/9/226定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)流式細(xì)胞儀第26頁/共35頁2023/9/227顯微光譜分析技術(shù)細(xì)胞中有一些成分具有特定的吸收光譜，核酸、蛋白質(zhì)、細(xì)胞色素、維生素等都有自己特征性的吸收曲線。例如，核酸的吸收波長為260nm，而蛋白質(zhì)的則為280nm。有的成分經(jīng)組織化學(xué)染色后，對可見光有特定的吸收光譜。根據(jù)細(xì)胞成分所具有的這種特性，可利用顯微分光光度計(jì)對某些成分進(jìn)行定位、定性，甚至定量測定。第27頁/共35頁2023/9/228第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法

第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法

第二節(jié)細(xì)胞組分的分析方法

第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)

第四節(jié)用于細(xì)胞生物學(xué)研究的模式生物第28頁/共35頁2023/9/229植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)

類型：原代培養(yǎng)細(xì)胞（primaryculturecell） 傳代培養(yǎng)細(xì)胞（sub-culturecell）

細(xì)胞系（cellline）

永生細(xì)胞系，如Hela細(xì)胞系

植物細(xì)胞 原生質(zhì)體培養(yǎng)（體細(xì)胞培養(yǎng)）

類型：單倍體細(xì)胞培養(yǎng)（花藥培養(yǎng)）

非細(xì)胞體系（cell-freesystem）

第29頁/共35頁2023/9/230細(xì)胞工程

細(xì)胞融合與細(xì)胞雜交技術(shù)

單克隆抗體技術(shù)（1984年諾貝爾獎(jiǎng)）

細(xì)胞拆合與顯微操作技術(shù)第30頁/共35頁2023/9/231顯微操作第31頁/共35頁2023/9/232第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法

第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法

第二節(jié)細(xì)胞組分的分析方法

第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)

第四節(jié)用于細(xì)胞生物學(xué)研究的模式生物第32頁/共35頁2023/9/233不同物種享有共