浮游植物葉綠素a測定方法的比較研究

浮游植物葉綠素a測定方法的比較研究

a芽、浮游生物密度和藻類分類是當(dāng)前浮游生物監(jiān)測的重要參數(shù)，對監(jiān)測和監(jiān)測洪水流量提供了最直接、最有效的數(shù)據(jù)。浮游植物密度和分類計(jì)數(shù)的分析難度大,對專業(yè)要求較高,分析進(jìn)度緩慢。相對而言,葉綠素a含量的測定方法較為簡單,其中分光光度法應(yīng)用最為廣泛?！端蛷U水監(jiān)測分析方法》(第四版增補(bǔ)版)采用分光光度法作為葉綠素a的常規(guī)監(jiān)測方法,以90%丙酮為溶劑研磨提取葉綠素a。該方法充分破碎藻類細(xì)胞壁,對葉綠素a的提取效率高。但研磨過程中葉綠素a容易發(fā)生光降解使結(jié)果偏低,提取過程繁瑣,人為誤差較大。此外,研磨過程花費(fèi)較多時間,與丙酮的接觸時間長,不利于操作人員的健康。不少研究從提取溶劑本文研究了3種濾膜(乙酸纖維濾膜、混合纖維濾膜和玻璃纖維濾膜)對葉綠素a測定結(jié)果的影響,比較了丙酮浸提法、丙酮研磨法、乙醇法和熱乙醇法的方法穩(wěn)定性和可替代性。1材料和方法1.1碳酸鎂懸濁液水樣取自中山市逸仙湖公園的人工湖湖水,樣品采集后立即加入1%碳酸鎂懸濁液(1L水樣加1%碳酸鎂懸濁液1ml),以防酸化引起色素波長偏移。3種濾膜:孔徑0.45μm的乙酸纖維濾膜(上海興亞)、孔徑0.45μm的混合纖維濾膜(天津津騰)、孔徑0.7μm的進(jìn)口玻璃纖維濾膜(WathmanGF/F);孔徑0.45μm的聚四氟乙烯針式抽濾器;玻璃研缽。1.2江蘇ws型真空泵(天津奧特賽恩AP-01D)、臺式低速離心機(jī)(江蘇恒豐TD5A-WS型)、恒溫水浴鍋(上海一恒HWS-24)、紫外可見光分光光度計(jì)(上海亞研電子UV1900PC)、醫(yī)用保溫冰箱(海爾DW-25W198)等。1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1%丙酮實(shí)驗(yàn)經(jīng)24h浸泡活化的乙酸纖維濾膜、混合纖維濾膜和玻璃纖維濾膜放入冰箱低溫干燥,分別放入10ml試管中,加入90%丙酮10ml,每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個平行。暗處浸提24h后,以90%丙酮作空白對照,測定上清液在630nm、645nm、663nm、750nm處的吸光值,比較3種濾膜對90%丙酮吸光度的影響。1.3.2不同溶劑提取液對樣品葉綠素a含量的影響分別用乙酸纖維濾膜、混合纖維濾膜和玻璃纖維濾膜過濾同一水樣丙酮研磨法是樣品濾膜剪碎后,加入90%丙酮、適量碳酸鎂充分研磨,于暗處浸提24h以90%丙酮為溶劑的方法,分別在630nm、645nm、663nm、750nm下測定提取液的吸光度,計(jì)算樣品葉綠素a含量1.3.3濾膜冷凍與否對乙醇法測定葉綠素a含量的影響將一組濃縮樣品的濾膜于-20℃下冷凍8h后,加入90%乙醇10ml,暗處萃取浸提24h,另一組濃縮樣品的濾膜直接加入90%乙醇10ml,暗處萃取浸提24h,每組實(shí)驗(yàn)3個平行,比較濾膜冷凍與否對乙醇法測定葉綠素a含量的影響。1.4數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)用SPSS(12.0中文版本)進(jìn)行顯著性分析(0.01<P<0.05差異顯著)。2結(jié)果和討論2.1分光光度計(jì)算c乙酸纖維濾膜和混合纖維濾膜均可溶解于90%丙酮。玻璃纖維濾膜吸水膨脹,但不發(fā)生溶解。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,三種濾膜的吸光度波動小于0.0010,在分光光度計(jì)的光度波動范圍內(nèi)(0.001Abs),750nm處吸光度符合小于0.005的要求(見表1)。經(jīng)檢驗(yàn),三種濾膜的實(shí)驗(yàn)結(jié)果無顯著性差異(P>0.05),對90%丙酮吸光度測定沒有影響。(表2)由于研磨時加入的碳酸鎂在傾倒上清液時容易再懸浮,使得上清液比色時750nm處吸光度超過0.005。即便用滴管小心吸取上清液,也容易帶出碳酸鎂。張幗等人2.2丙酮浸提法和丙酮研磨法的比較如圖1所示,分別用乙酸纖維濾膜、混合纖維濾膜、玻璃纖維濾膜過濾同一水樣,三種濾膜對丙酮浸提法和丙酮研磨法測定的葉綠素a含量無顯著影響(P>0.05)。盡管乙酸纖維濾膜和混合纖維濾膜能溶解在丙酮中,但在本實(shí)驗(yàn)中對測定結(jié)果無影響,所以可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室獲得便利及價格來選擇使用以上三種濾膜進(jìn)行葉綠素a測定,這與林少君等人在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上,丙酮浸提法和丙酮研磨法測定葉綠素a無顯著差異,兩種方法可以相互替代。但丙酮研磨法測定的結(jié)果稍低,誤差較大,可能是研磨步驟較多,多次轉(zhuǎn)移,造成樣品損失。與丙酮浸提法測定結(jié)果的平均值比較,研磨法所造成的損耗率為16.68~41.10%,平均值為32.91%。一些研究者2.3乙醇法替代熱乙醇法熱乙醇法多了80℃水浴2min的步驟,測定結(jié)果和乙醇法的沒有顯著差異(P>0.05)。熱乙醇法的平行性差,偏差較大(圖2),加熱過程中80℃水浴較難控制,容易發(fā)生樣品噴發(fā)而造成樣品損失,建議用乙醇法直接替代熱乙醇法測定葉綠素a含量。楊玉珍等人如圖3所示,濾膜富集樣品后,是否在-20℃下冷凍8h對乙醇法測定葉綠素a含量沒有顯著差異(P>0.05)。未冷凍直接浸提只是利用乙醇溶液滲透到藻細(xì)胞內(nèi)提取葉綠素a。-20℃下冷凍8h后再用90%乙醇萃取,冷凍再融解的過程可以引起細(xì)胞溶漲2.4不同提取方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析經(jīng)顯著性分析,本實(shí)驗(yàn)中丙酮浸提法與乙醇法的測定結(jié)果有顯著性差異(P<0.05),其它方法的測定結(jié)果并無顯著性差異(見圖4)。相對于丙酮研磨法和熱乙醇法,丙酮浸提法和乙醇法的標(biāo)準(zhǔn)偏差較小,前處理步驟簡化,只需將濾膜放入離心管,加入萃取劑后靜置浸提24h,整個提取過程沒有溶液的轉(zhuǎn)移,操作簡便,轉(zhuǎn)移損失更小。從統(tǒng)計(jì)意義上來說,丙酮浸提法的測定結(jié)果普遍比乙醇法高,說明90%丙酮提取浮游植物的葉綠素a較90%乙醇提取更完全。這是因?yàn)楸拇┩感詮?qiáng),容易滲透到浮游植物細(xì)胞中,而乙醇的性質(zhì)決定了其萃取效率不高由于丙酮法作為標(biāo)準(zhǔn)方法被長期使用,為了歷史數(shù)據(jù)的可比性,可以使用步驟簡化但更安全的丙酮浸提法。乙醇法無毒害,結(jié)果可靠,建議在水體浮游植物葉綠素a監(jiān)測工作中推廣。3葉綠素a含量3.1乙酸纖維濾膜、混合纖維濾膜、玻璃纖維濾膜對90%丙酮的吸光度影響很小,對丙酮浸提法與研磨法的測定結(jié)果無顯著影響,可以根據(jù)需要選擇以上三種濾膜。3.2丙酮浸提法與研磨法測定的葉綠素a含量無顯著差異,可相互替換,但丙酮研磨法的平均損耗率為32.91%,誤差較大。3.3乙醇法與熱乙醇法測定的葉