碩士研究生畢業(yè)答辯《南方紅豆杉水提物聯(lián)合吉非替尼抑制HGFMET通路抗人非小細(xì)胞肺癌移植瘤吉非替尼耐藥的實(shí)驗研究》論文模板

前言肺癌是導(dǎo)致腫瘤相關(guān)性死亡的最主要原因，每年超過100萬人因肺癌死亡。其中，非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）占肺癌的75-85%，其中，腺癌（約占40%），鱗癌（約占35-45%）是NSCLC最主要的兩種亞型[1]。在美國，每年約有22萬患者被新診斷肺癌，16萬肺癌患者死亡[2]，其中大部分NSCLC患者發(fā)現(xiàn)時即處于Ⅲ、Ⅳ期[3]，失去了手術(shù)根治的機(jī)會，5年生存率僅15%[4]。當(dāng)前，以鉑類為基礎(chǔ)的雙藥化療方案是NSCLC的一線治療手段，近年來研究的以培美曲塞、多西紫杉醇為代表的單藥化療維持治療也被NCCN指南推薦應(yīng)用于臨床。但是，以放、化療為代表的NSCLC傳統(tǒng)治療手段目前無突破性的進(jìn)展或研究顯示能顯著提升患者的生存期。隨著對NSCLC自然病程的研究，眾多分子標(biāo)記物被發(fā)現(xiàn)，以表皮生長因子受體為靶點(diǎn)的表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermalgrowthfactorreceptorkinaseinhibitors,EGFR-TKIs）已廣泛應(yīng)用于臨床，2015年NCCN非小細(xì)胞肺癌指南推薦多種EGFR-TKIs用于NSCLC的一線、二線治療。吉非替尼（易瑞沙）是一種可逆性EGFR-TKI，可以通過選擇性的酶抑制劑或單克隆抗體競爭性結(jié)合細(xì)胞外配體結(jié)合位點(diǎn)可以阻斷酪氨酸激酶活化，從而抑制EGFR的激活，在中晚期EGFR突變的非小細(xì)胞肺癌患者中廣為應(yīng)用。但是，以吉非替尼為代表的EGFR-TKIs耐藥不可避免，其中位有效期僅為5-9個月，加之其昂貴的價格，使其進(jìn)一步的應(yīng)用受到了局限。當(dāng)前，被普遍認(rèn)同的EGFR-TKI的耐藥機(jī)制為EGFR基因的二次突變學(xué)說和EGFR旁路HGF/MET通路的激活學(xué)說。HGF/MET通路激活導(dǎo)致的c-MET擴(kuò)增或過表達(dá)是導(dǎo)致臨床EGFR-TKIs治療NSCLC失敗的重要原因，在TKIs耐藥的患者中發(fā)生率約為（5-22%），遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于未經(jīng)EGFR-TKIs治療的患者（約3%）[5]。因此，尋找合適的藥物延緩甚至克服由c-MET擴(kuò)增或過表達(dá)導(dǎo)致的EGFR-TKIs耐藥是當(dāng)前NSCLC治療中的重點(diǎn)和難點(diǎn)。以“整體觀”、“辨證論治”為綱的中醫(yī)藥治療具有多靶點(diǎn)、多效應(yīng)、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)，在腫瘤的治療上具有獨(dú)特的優(yōu)勢。基于此，中醫(yī)藥與EGFR-TKIs聯(lián)合治療非小細(xì)胞肺癌不失為一良策。南方紅豆杉是我國傳統(tǒng)中草藥，在我國南方廣泛，并在我省實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化種植。其性平，味苦，有小毒，歸心經(jīng)，功效為消腫散結(jié)。我們的前期研究表明，南方紅豆杉水提物的作用機(jī)制與紫杉醇不同[6]，南方紅豆杉水提物與吉非替尼有協(xié)同作用，可以下調(diào)多種吉非替尼耐藥的NSCLC細(xì)胞株HGF/MET下游的PI3K/AKT、STAT3、ERK通路相關(guān)蛋白和mRNA的表達(dá)。針對南方紅豆杉水提物的安全性，本課題組亦通過前期研究得以驗證：荷人肺癌A549裸鼠連續(xù)30天予高、中、低劑量的南方紅豆杉水提物灌胃后，其血常規(guī)、生化指標(biāo)均正常且與生理鹽水給藥的對照組相較無顯著性差異。為了進(jìn)一步研究南方紅豆杉水提物對HGF/MET信號通路的作用，明確南方紅豆杉水提物的作用靶點(diǎn)，本課題選取1種吉非替尼敏感（PC9）人肺癌細(xì)胞株，3種吉非替尼耐藥（PC9/R、A549、H1975）的人肺癌細(xì)胞株構(gòu)建裸鼠移植瘤模型，以裸鼠移植瘤為研究對象，采用Western-blot法檢測MET、ErbB3及其磷酸化的蛋白表達(dá)，采用RT-PCR法檢測MET、ErbB3的mRNA表達(dá)，探討南方紅豆杉水提物、南方紅豆杉水提物聯(lián)合吉非替尼對荷上述NSCLC腫瘤細(xì)胞裸鼠移植瘤HGF/MET通路相關(guān)分子標(biāo)記物的影響，明確南方紅豆杉水提物對抗吉非替尼耐藥的機(jī)制。

實(shí)驗研究一、材料與方法（一）實(shí)驗材料1.實(shí)驗室浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗中心浙江省中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實(shí)驗室2.實(shí)驗細(xì)胞人肺腺癌A549（EGFR野生型，吉非替尼耐藥耐藥細(xì)胞株）細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，人肺腺癌H1975（EGFRexon20T790M-L858R，吉非替尼耐藥細(xì)胞株）、PC9（EGFRexonl9delE746-A750吉非替尼敏感細(xì)胞株）、PC9/R（EGFR突變型，吉非替尼耐藥細(xì)胞株）細(xì)胞株由同濟(jì)大學(xué)附屬上海肺科醫(yī)院周彩存教授惠贈。3.實(shí)驗動物雄性BALB/c裸鼠180只，4-6周齡，體重16-18g，（SPF級，上海西普爾-必凱實(shí)驗動物有限公司，許可證號：SCXK（滬）2013-0016）。4.動物受試藥（1）南方紅豆杉飲片購于浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房，生產(chǎn)商為寧波泰康紅豆杉生物工程有限公司，生產(chǎn)批號：100513。（2）吉非替尼標(biāo)準(zhǔn)品:由AstraZenecaUKLimited提供，規(guī)格:250mg/片，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字J20100014。（3）生理鹽水：購于浙江省中醫(yī)院西藥房，生廠商為杭州民生藥業(yè)集團(tuán)有限公司。5.實(shí)驗儀器SENCOR-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海中順生物科技有限公司AL204/01型電子天平瑞士梅特勒公司DGG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海森信實(shí)驗儀器有限公司DK-80型電熱恒溫水浴箱上海精宏實(shí)驗設(shè)備有限公司3111型水套式CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱美國Thermo公司細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、96孔板美國CORNING公司1285型單人生物安全柜美國Thermo公司CL31R型大容量冷凍離心機(jī)美國Thermo公司CL21R型微量高速冷凍離心機(jī)美國Thermo公司Elx808型酶標(biāo)儀美國BioTek公司702型-80℃超低溫冰箱美國Thermo公司SIM-F140型制冰機(jī)日本SANYO公司NanopureUV/UF型超純水器美國Thermo公司MP4+ChemidocXRS型蛋白印記檢測系統(tǒng)美國Bio-Rad公司REC2304型液相層析柜美國REVCO公司ESHK02型側(cè)擺脫色搖床江蘇碧云天生物技術(shù)研究所ECF011型手掌型微型離心機(jī)江蘇碧云天生物技術(shù)研究所ESHK05型微型振蕩器江蘇碧云天生物技術(shù)研究所Thermocell型干式恒溫器杭州博日科技有限公司BX20型熒光顯微鏡攝像機(jī)日本OLYMPUS公司W(wǎng)estern-Blot套裝設(shè)備美國Bio-Rad公司核酸電泳儀及電泳槽美國Bio-Rad公司NanoDrop1000紫外分光光度計美國Thermo公司ABI9700PCR擴(kuò)增儀美國ABI公司ABI7500全自動熒光定量PCR儀美國ABI公司384孔板（PCR-384M2-C）美國Axygen公司6.實(shí)驗試劑（1）細(xì)胞培養(yǎng)試劑GIBCO胎牛血清：美國GIBCO公司RPMI-1640培養(yǎng)液：科益生物技術(shù)有限公司F12-K培養(yǎng)液:吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司DMEM高糖培養(yǎng)液:科益生物技術(shù)有限公司0.25%胰酶-EDTA：吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司二甲基亞砜（DMSO）：美國Sigma公司0.01MPBS：科益生物技術(shù)有限公司（2）Western-blot試劑RIPA裂解液（強(qiáng)）：江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司蛋白酶抑制劑：杭州科易生物技術(shù)有限公司磷酸酶抑制劑：杭州科易生物技術(shù)有限公司Tris:美國AMRESCO公司1.0mol/LTris?HCl（pH6.8和7.5）：杭州科易生物技術(shù)有限公司

1.5

mol/LTris?HCl（pH8.8）：杭州科易生物技術(shù)有限公司

30％Acr/Bic（29：1）：杭州科易生物技術(shù)有限公司

2*上樣緩沖液：杭州科易生物技術(shù)有限公司

5*上樣緩沖液：杭州科易生物技術(shù)有限公司

蛋白標(biāo)準(zhǔn)品：杭州科易生物技術(shù)有限公司過硫酸胺（APS）：愛建德固賽引發(fā)劑有限公司丙稀酰胺（Acr）：美國AMRESCO公司十二烷基磺酸鈉（SDS）：美國AMRESCO公司Tween-20：美國Bio-Rad公司TEMED：美國Bio-Rad公司甘氨酸（Glycine）：美國AMRESCO公司NaCl：上海試四赫維化工有限公司ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒：美國Millipore公司PVDF膜：美國Millipore公司膜再生液：杭州科易生物技術(shù)有限公司脫脂奶粉：上海光明乳業(yè)股份有限公司溴酚蘭、甘油、β-巰基乙醇：美國Sigma公司蛋白Marker:加拿大Fermentes公司β-actin一抗：美國Abcam公司Met、p-Met、ErbB3、p-ErbB3一抗:美國CellSignalingTechnology公司羊抗鼠、羊抗兔二抗：美國SantaCruz公司（3）RT-PCR試劑RNAisoPlus：寶生物工程（大連）有限公司焦炭酸二乙酯（DEPC）：寶生物工程（大連）有限公司PrimeScriptRTMasterMix：寶生物工程（大連）有限公司SYBRPremixEXTaq：寶生物工程（大連）有限公司7.主要試劑的制備（1）10％SDSSDS（十二烷基磺酸鈉）10g蒸餾水至100ml50℃水浴下溶解，室溫保存。SDS需在通風(fēng)柜內(nèi)取樣。（2）10％過硫酸銨（APS）過硫酸銨0.1g超純水1.0ml現(xiàn)配現(xiàn)用，4度不超過一周。（3）10×電泳緩沖液Tris30.3g甘氨酸187.7gSDS10g蒸餾水至1000ml混勻后室溫保存。1×電泳緩沖液：每100ml加蒸餾水至1L。（4）10×轉(zhuǎn)移緩沖液Tris58g甘氨酸29gSDS3.7g蒸餾水至1000ml混勻后室溫保存。1×轉(zhuǎn)移緩沖液：每100ml加入200ml甲醇，蒸餾水至1L。（5）10×TBS緩沖液1mol/LTris·HCl（pH7.5）100mlNaCl88g蒸餾水至1000ml混勻后室溫保存。（6）1×TBST緩沖液Tween20200ul-2ml10×TBS100ml蒸餾水至1000ml（6）封閉液（5％脫脂奶粉）脫脂奶粉（國產(chǎn)，光明牌）5g1×TBST100ml（二）實(shí)驗方法1.動物受試藥的制備（1）南方紅豆杉水提物配制將40g南方紅豆杉飲片置于醫(yī)用不銹鋼鍋，浸泡過夜，加8倍水煮沸30min，倒出藥液，后加8倍水煮沸20min，再加5倍水煮沸20min，將3次藥液經(jīng)真空抽濾器過濾，置于電磁爐上濃縮至終濃度為104mg（生藥量）/ml，按每只小鼠灌胃劑量0.1ml/10克濃縮藥液，過濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆谩＃?）吉非替尼藥液配置根據(jù)“人和動物體表面積折算的等效劑量”比率表，將吉非替尼片（易瑞沙）250mg，配制成5mg/ml的混懸液，用生理鹽水溶解，按每只裸鼠灌胃劑量0.1ml/10克定容，過濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆谩?.人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的復(fù)蘇、凍存、計數(shù)及培養(yǎng)和傳代（1）細(xì)胞的復(fù)蘇①操作人員應(yīng)戴防護(hù)面罩及手套，防止冷凍管爆裂可能造成操作人員的傷害。②將保存在-80℃冰箱中裝有各細(xì)胞株的凍存管迅速置于37℃恒溫水浴中，邊搖邊融。③待溶解后，用酒精消毒后開啟，用移液器吸出細(xì)胞懸液，注入含3-5ml10%胎牛血清培養(yǎng)液的15ml離心管中。④混勻后800r/min離心5min，去上清液，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液3ml，混勻，移至25cm2培養(yǎng)瓶中。⑤再加入3ml培養(yǎng)液，置5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中孵育。（2）細(xì)胞的凍存①對數(shù)生長期的細(xì)胞，凍存前24小時換液，使細(xì)胞處于良好的營養(yǎng)狀態(tài)。②按下述方法制備細(xì)胞凍存培養(yǎng)基:無血清培養(yǎng)基7/10，F(xiàn)BS2/10，DMSO1/10。③離心收獲細(xì)胞，計數(shù)，800rpm離心5分鐘，去上清。④沉淀加含保護(hù)液的培養(yǎng)基，計數(shù)，調(diào)整至5×106/ml左右。⑤用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，1ml管分裝到無菌凍存管內(nèi)。⑥用封口膠，將凍存管口封嚴(yán)。封口一定要嚴(yán)，否則復(fù)蘇時易出現(xiàn)爆裂。⑦按下列順序降溫：室溫→4℃（30min）→低溫冰箱-20℃（30min）→超低溫冰箱-80℃（數(shù)天）→液氮（長期）。（3）細(xì)胞的計數(shù)①將血細(xì)胞計數(shù)板和蓋玻片用75%酒精擦凈，干燥后將蓋玻片放在計數(shù)室。②收集細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞做適當(dāng)稀釋，微量加樣器吸取10ul細(xì)胞于計數(shù)板上蓋玻片一端將液體注入其下方的計數(shù)室內(nèi)。③靜置1分鐘，顯微鏡下觀察并計算出四角大格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)。④將計數(shù)結(jié)果按以下公式計算出細(xì)胞密度：細(xì)胞密度（萬/ml）=(四大格細(xì)胞總數(shù)/4)*10，000*稀釋倍數(shù)。（4）細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代①人肺腺癌細(xì)胞株在含10%胎牛血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)（其中A549細(xì)胞株培養(yǎng)液為F12-K；PC9、PC9/R細(xì)胞株培養(yǎng)液為DMEM；H1975細(xì)胞株培養(yǎng)液為1640），培養(yǎng)箱保持在5%CO2、37℃、飽和濕度條件下，根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)每1～2天更換培養(yǎng)液1次。②待細(xì)胞單層鋪滿培養(yǎng)瓶后，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗去殘余培養(yǎng)液，加消化液（0.25%胰酶-EDTA）1-2ml，置培養(yǎng)箱內(nèi)2～3min，再把培養(yǎng)瓶放倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞變圓且已有細(xì)胞開始懸浮時，加入1-1.5倍于消化液的含10%胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化。③輕輕反復(fù)吹打培養(yǎng)瓶底部，將細(xì)胞懸液移入離心管中，800rpm離心5min，棄上清液。④再用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，細(xì)胞密度控制在105個/ml左右，移入培養(yǎng)瓶中，于37℃、5％CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。⑤每1～2天換液1次，3～4天傳代1次。取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗。3.裸鼠移植瘤模型的建立與分組采用BALB/c裸鼠180只進(jìn)行實(shí)驗（A549、PC9、PC9/R、H1975，每種細(xì)胞株40只）。取處于對數(shù)生長期人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，PC9、PC9/R、H1975濃度調(diào)整為1-2×106/ml，A549濃度調(diào)整為5-10×106/ml。將不同人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株接種于裸鼠右腋皮下，每只裸鼠右腋皮下接種0.2ml，10天后，剔除未成瘤裸鼠。裸鼠成瘤后，計算成瘤率。每種細(xì)胞株接種的BALB/c裸鼠均隨機(jī)分為4組，分別為南方紅豆杉水提物組、吉非替尼組、南方紅豆杉聯(lián)合吉非替尼組以及對照組。每組10只。連續(xù)灌胃4周。其中，南方紅豆杉水提物組灌胃量為南方紅豆杉10.4mg/10g/d，吉非替尼組灌胃量為吉非替尼0.5mg/10g/d，聯(lián)合組灌胃量為南方紅豆杉10.4mg/10g/d+吉非替尼0.5mg/10g/d，對照組灌胃量為NS0.1ml/10g/d。4.裸鼠移植瘤瘤塊組織的提取上述成瘤裸鼠結(jié)束灌胃后24h，在冰上取瘤塊組織，每只裸鼠瘤塊保持薄膜完整，-80℃保存?zhèn)溆?，待行Western-Blot、RT-PCR等試驗。5.對裸鼠移植瘤目的蛋白表達(dá)的Western-Blot檢測（1）裸鼠移植瘤蛋白的提取①取適量RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、蛋白磷酸化酶抑制劑，于冰上放置融解，混勻，短暫離心使沉到管底。②取綠豆樣大的移植瘤組織，先用預(yù)冷的PBS或生理鹽水漂洗移植瘤組織數(shù)次，以清除表面的血跡，然后將組織切成1mm見方的小組織塊，置于EP管中。③按每20mg組織加入150ul~250ul的RIPA裂解液，1.5~2.5ul的蛋白酶抑制劑，1.5~2.5ul的蛋白磷酸化酶抑制劑（RIPA裂解液與蛋白酶抑制劑、蛋白磷酸化酶抑制劑的比例為100:1）。④在冰上用電動勻漿器勻漿組織，至組織充分裂解。⑤于冰上靜置組織30min，每10min震蕩一次，每次30-60s。⑥離心機(jī)預(yù)冷后4℃下12000rpm離心15min。⑦取上清液轉(zhuǎn)移至于EP管中。⑧4℃下重復(fù)離心15min一次，取上清液轉(zhuǎn)移至EP管中，可放置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。?）BCA法測定蛋白濃度①將蛋白標(biāo)準(zhǔn)品放置于冰上溶解、混勻。②根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B(50:1)配制適量BCA工作液，充分混勻，工作液呈綠色。③將蛋白標(biāo)準(zhǔn)品按0，1，2，4，8，12，16，20μl加到96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加蒸餾水補(bǔ)足到20μl。④加適當(dāng)體積待測蛋白到96孔板的樣品孔中，加蒸餾水稀釋至20μl（待測蛋白與蒸餾水比例為1:24）。⑤各孔加入200μlBCA工作液。⑥培養(yǎng)箱中孵育30min，酶標(biāo)儀在562nM處測定OD值，所得數(shù)據(jù)用excel軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品蛋白濃度及蛋白樣本的上樣體積，上樣量統(tǒng)一為30ug。（3）SDS－PAGE電泳①清洗玻璃板：一只手扣緊玻璃板，另一只手蘸點(diǎn)洗衣粉輕輕擦洗。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。②灌膠與上樣（配膠和灌膠在通風(fēng)柜內(nèi)操作）：a玻璃板對齊后垂直放入夾中后卡緊，雙蒸水檢漏5-10min。準(zhǔn)備灌膠。b配制8-12％分離膠，最后加入TEMED后立即搖勻、灌膠，待膠面升到綠帶中間線高度時即可。膠上加1ml異丙醇以去除氣泡及加速凝膠。加異丙醇時盡量避免對凝膠的沖擊，膠面均勻鋪上一層異丙醇即可。c上層液體與膠之間出現(xiàn)一條折射帶時，膠已凝固。充分凝固后倒去異丙醇并用蒸餾水沖洗一遍，吸水紙吸干。d配制5％濃縮膠，最后加入TEMED后立即搖勻，灌膠，插入梳子，插梳子時保持正中及水平。灌膠時避免膠中產(chǎn)生氣泡。凝固過程中膠面尤其是膠的兩邊可能會有所下降，應(yīng)適時補(bǔ)加凝膠。e根據(jù)移植瘤蛋白的濃度將蛋白樣品按1︰1比例加入2×SDS或5×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5-10min使蛋白變性，立即放冰上。根據(jù)所測樣品蛋白濃度，計算含30μg蛋白的溶液體積為上樣量?？芍糜?80℃冰箱保存。f濃縮膠凝固后，將玻璃板和膠一起拿出，放入電泳槽。電泳槽中由內(nèi)到外倒入足夠的電泳液，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出，開始上樣。g用微量加樣器貼壁吸取樣品，加樣器槍頭插至加樣孔中垂直緩慢加入樣品，不能抵住玻板，避免膠與玻板脫離。樣品沉入加樣孔底部后再撤出加樣器。③電泳：插上電源，開始電泳，注意正負(fù)極。電泳電壓濃縮膠60V～80V，分離膠90-120V，時間2～4h。溴酚藍(lán)到達(dá)膠底端時，終止電泳。（4）轉(zhuǎn)膜①將剪好的PVDF膜（5cm×7cm，剪右上角作為正面標(biāo)記）置于甲醇中浸泡處理10min（浸透即可），然后在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡10-15min以除去甲醇。②在加有轉(zhuǎn)移緩沖液的搪瓷盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、海綿墊、玻棒、剪好的濾紙和處理過的PVDF膜。③將夾子打開使黑面保持水平，上面墊一張海綿墊及四張濾紙，用玻棒搟走里面的氣泡。④將玻璃板撬開，將濃縮膠刮去，剝下分離膠蓋于濾紙上，使其與濾紙對齊，用玻棒搟去氣泡。將PVDF膜蓋于膠上（蓋滿整個膠）并除去氣泡。在膜上蓋四張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個海綿墊，合起夾子。膜和膠之間不能有氣泡。膠在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡數(shù)分鐘有利于SDS的去除，利于轉(zhuǎn)膜。⑤將夾子放入轉(zhuǎn)移槽中，夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。槽中加滿轉(zhuǎn)移緩沖液，4℃層析柜中30mA轉(zhuǎn)膜過夜，或250mA轉(zhuǎn)膜2.5h。（5）免疫反應(yīng)①轉(zhuǎn)膜后將膜用TBST淋洗一遍，然后移至含有封閉液（10%脫脂奶粉）的平皿中（膜的正面即蛋白面朝上），室溫下脫色搖床上搖動封閉1h或4℃封閉過夜。②將一抗用封閉液稀釋至適當(dāng)濃度（15ml離心管中，3ml）。從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留液后，將膜的蛋白面朝內(nèi)卷曲置入15ml離心管中，與一抗充分接觸，室溫下旋轉(zhuǎn)孵育2-3h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗三次，每次10min。③同上方法準(zhǔn)備二抗稀釋液并與膜充分接觸，室溫下孵育1-2h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗三次，每次10min。（6）化學(xué)發(fā)光，顯影，拍照①將ECL發(fā)光試劑盒中A、B兩種試劑在離心管內(nèi)等體積混合。將膜蛋白面朝上放在保鮮膜上，將ECL混合液滴加在PVDF膜上，避光反應(yīng)3-5min，放入蛋白印記檢測系統(tǒng)的暗箱內(nèi)。②根據(jù)信號的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光拍攝時間（一般為1～5min），以達(dá)最佳效果，記錄實(shí)驗結(jié)果。凝膠圖象分析：將不同時間所拍圖片，以β-actin內(nèi)參作為進(jìn)行蛋白灰度分析。6.對裸鼠移植瘤目的mRNA表達(dá)的RT-PCR檢測（1）總RNA的提?、偌羧〕蜏貎鼋Y(jié)的瘤塊組織約綠豆大小（80-100mg）放入1.5ml離心管中。②在離心管中內(nèi)加入1mlRNAiosPlus，剪碎瘤塊組織后，把離心管置于冰浴中進(jìn)行勻漿，直至勻漿液呈無顆粒透明狀，室溫下靜置5分鐘。③4℃12000rpm離心5分鐘，小心吸取上清液，移到新的離心管中（切勿吸取沉淀）。④向上述離心管中加入200μl氯仿（為RNAiosPlus體積的1/5），劇烈振蕩30秒，充分乳化后室溫靜置10分鐘。⑤4℃12000rpm離心15分鐘，從離心機(jī)中小心取出離心管，此時勻漿液分為三層，即：無色的上清液、中間的白色蛋白層及帶有顏色的下層有機(jī)相。吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中（切勿吸取白色中間層）。上清液量約為600μl。⑥向上清液中加入等體積異丙醇（約600μl），上下顛倒混勻后室溫下靜置10分鐘，4℃12000g離心10分鐘。⑦小心棄去上清，緩慢沿離心管壁加入75%的乙醇1ml（0.1%DEPC水配制），輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁，4℃12000g離心5分鐘后小心棄去乙醇。⑧沉淀室溫干燥90分鐘后，加入0.1%DEPC水100u溶解沉淀，吹打混勻。⑨取1-2μl溶解后的RNA用紫外分光光度計上測定RNA濃度，確定RNA的純度及濃度，A260/A280應(yīng)在1.8～2.0之間，RNA濃度應(yīng)在300-600ng/μl之間。（2）逆轉(zhuǎn)錄①按逆轉(zhuǎn)錄所需RNA量，取不同體積的RNA樣品，用DEPC水調(diào)節(jié)使其在反應(yīng)體系中保持統(tǒng)一濃度。②反應(yīng)體系：TotalRNA—5×PrimeScriptRTMasterMix2μlRnaseFreedH2Oupto10μlTotal10μl③反應(yīng)條件：37℃15min85℃5sec4℃forever（3）實(shí)時熒光定量PCR①引物：GAPDH上游引物為5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’。GAPDH下游引物為5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。MET上游引物為5’-CTGCCTGCAATCTACAAGGT-3’。MET下游引物為5’-ATGGTCAGCCTTGTCCCTC-3’。ErbB3上游引物為5’-GACCCAGGTCTACGATGGGAA-3’。ErbB3下游引物為5’-GTGAGCTGAGTCAAGCGGAG-3’。②反應(yīng)體系SYBRPremixExTaqTM(2×)5μlPCRForwardPrimer(10μm)0.2μlPCRReversePrimer(10μm)0.2μlROXReferenceDye(50×)0.2μlDNA模板1μldH2O3.4μlTotal10μl③反應(yīng)條件Stage1：預(yù)變性Reps：195℃30sec.Stage2：PCR反應(yīng)Reps：4095℃5sec.60℃34sec.Stage3：溶解曲線分析95℃15sec.60℃1min.95℃15sec.④熒光定量結(jié)果采用2-△△ct方法分析，統(tǒng)計相對表達(dá)量的差值RQ值③熒光定量結(jié)果采用2-△△ct方法分析，統(tǒng)計相對表達(dá)量的差值RQ值7.統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)輸入計算機(jī)，用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析處理。計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，檢測計量資料數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布及方差齊性。兩組間差異選用獨(dú)立樣本t檢驗，多組間差異選用ANOVA單因素方差分析，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01認(rèn)為有顯著性差異。二、結(jié)果（一）4種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系裸鼠移植瘤模型的建立將4種細(xì)胞系的細(xì)胞以1×107個/ml的濃度接種于裸鼠，每只裸鼠接種0.2ml，約2×107個細(xì)胞，觀察7-14天可見，接種PC9、PC9/R、A549、H19753種細(xì)胞系裸鼠的成瘤只數(shù)分別為40只、40只、36只、40只?？梢奝C9、PC9/R、H1975移植瘤裸鼠的成瘤率均為100%，A549移植瘤裸鼠的成瘤率為90%。圖1：成瘤裸鼠個數(shù)表1：4種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系裸鼠移植瘤的成瘤率PC9PC9/RA549H1975成瘤裸鼠40403640未成瘤裸鼠0040成瘤率（%）100%100%90%100%（二）南方紅豆杉水提物聯(lián)合吉非替尼對4種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系移植瘤HGF/MET通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響1.南方紅豆杉水提物聯(lián)合吉非替尼對荷PC9裸鼠移植瘤HGF/MET通路通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響由下圖和下表可見，因PC9為吉非替尼敏感細(xì)胞株，因此吉非替尼組、南方紅豆杉水提物聯(lián)合吉非替尼組裸鼠在用藥后瘤塊組織組織消失。在荷PC9裸鼠移植瘤中，南方紅豆杉水提物單藥組較對照組能夠顯著下調(diào)荷PC9裸鼠移植瘤p-MET、ERBB3、p-ERBB3的表達(dá)（P<0.01）。上調(diào)MET的表達(dá)（P<0.01）。圖2-1：荷PC9裸鼠移植瘤蛋白表達(dá)水平圖2-2：荷PC9裸鼠移植瘤蛋白灰度比注：1.H組為南方紅豆杉水提物組，D組為對照組。表2：南方紅豆杉水提物聯(lián)合吉非替尼對荷PC9裸鼠移植瘤蛋白表達(dá)影響指標(biāo)組別HDβ-actine1.0001.000MET1.033±0.025**0.960±0.010p-MET0.543±0.015**1.327±0.015ERBB31.160±0.020**0.840±0.010p-ERBB30.290±0.017**1.476±0.031注：H組為南方紅豆杉水提物組，D組為對照組。2.與對照組比較，*表示0.01<P<0.05，**表示P<0.012.南方紅豆杉水提物聯(lián)合吉非替尼對荷PC9/R裸鼠移植瘤HGF/MET通路通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響由下圖和下表可見，吉非替尼單藥組能夠顯著上調(diào)荷PC9/R裸鼠移植瘤MET、p-MET的表達(dá)（P<0.01），下調(diào)ERBB3的表達(dá)（P<0.05），顯著下調(diào)p-ERBB3的表達(dá)（P<0.01）。相較于吉非替尼組，南方紅豆杉水提物聯(lián)合吉非替尼組能夠顯著下調(diào)荷PC9/R裸鼠移植瘤MET、p-MET、ERBB3、p-ERBB3的表達(dá)（P<0.01）。南方紅豆杉水提物單藥組較對照組亦能夠顯著下調(diào)MET、p-MET、ERBB3、p-ERBB3的表達(dá)（P<0.01）。圖3-1：PC9/R裸鼠移植瘤蛋白表達(dá)水平圖3-2：荷PC9/R裸鼠移植瘤蛋白灰度比注：1.H組為南方紅豆杉水提物組，G組為吉非替尼組，H+G組為吉非替尼聯(lián)合南方紅豆杉水提物組，D組為對照組。表3：南方紅豆杉水提物聯(lián)合吉非替尼對荷PC9/R裸鼠移植瘤蛋白表達(dá)影響指標(biāo)組別HGH+GDβ-actine1.0001.0001.0001.000MET0.747±0.046**▲1.313±0.038**0.777±0.056**▲0.973±0.090▲p-MET0.707±0.029**▲1.573±0.125**0.480±0.020**▲1.177±0.116▲ERBB30.737±0.021**▲1.110±0.036*0.983±0.038**▲1.180±0.040△p-ERBB30.793±0.006**▲0.690±0.010**0.483±0.012**▲2.256±0.032▲注：1.H組為南方紅豆杉水提物組，G組為吉非替尼組，H+G組為吉非替尼聯(lián)合南方紅豆杉水提物組，D組為對照組。2.與對照組比較，*表示0.01<P<0.05，**表示P<0.01；與吉非替尼組單藥組比較，△表示0.01<P<0.05，▲表示P<0.01。3.南方紅豆杉水提物聯(lián)合吉非替尼對A549移植瘤HGF/MET通路通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響由下圖和下表可見，吉非替尼單藥組能夠顯著上調(diào)MET、p-MET、ERBB3、p-ERBB3的表達(dá)（P<0.01）。相較于吉非替尼組，南方紅豆杉水提物聯(lián)合吉非替尼組能夠顯著下調(diào)荷A549裸鼠移植瘤MET、p-MET、ERBB3、p-ERBB3的表達(dá)（P<0.01）。南方紅豆杉水提物單藥組較對照組能夠顯著下調(diào)ERBB3的表達(dá)（P<0.01），能上調(diào)MET、p-MET、p-ERBB3的表達(dá)（P<0.01）。圖4-1：荷A549裸鼠移植瘤蛋白表達(dá)水平圖4-2：荷A549裸鼠移植瘤蛋白灰度比注：1.H組為南方紅豆杉水提物組，G組為吉非替尼組，H+G組為吉非替尼聯(lián)合南方紅豆杉水提物組，D組為對照組。表4：南方紅豆杉水提物聯(lián)合吉非替尼對荷A549裸鼠移植瘤蛋白表達(dá)影響指標(biāo)組別HGH+GDβ-actine1.0001.0001.0001.000MET1.133±0.072**▲1.507±0.025**0.767±0.045**▲0.377±0.006▲p-MET0.947±0.025**▲1.453±0.031**0.623±0.006**▲0.443±0.06▲ERBB30.410±0.010**▲1.217±0.035**1.097±0.047**▲0.823±0.015▲p-ERBB30.867±0.012**▲1.470±0.026**0.540±0.010▲0.560±0.000▲注：1.H組為南方紅豆杉水提物組，G組為吉非替尼組，H+G組為吉非替尼聯(lián)合南方紅豆杉水提物組，D組為對照組。2.與對照組比較，*表示0.01<P<0.05，**表示P<0.01；與吉非替尼組單藥組比較，△表示0.01<P<0.05，▲表示P<0.01。4.南方紅豆杉水提物聯(lián)合吉非替尼對H1975移植瘤HGF/MET通路通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響由下圖和下表可見，吉非替尼單藥組能夠顯著上調(diào)ERBB3、p-ERBB3的表達(dá)（P<0.01）。相較于吉非替尼組，南方紅豆杉水提物聯(lián)合吉非替尼組能夠顯著下調(diào)荷H1975裸鼠移植瘤p-MET、ERBB3、p-ERBB3的表達(dá)（P<0.01），上調(diào)MET的表達(dá)（P<0.01）。南方紅豆杉水提物單藥組較對照組亦能夠顯著下調(diào)MET、p-MET、p-ERBB3的表達(dá)（P<0.01），上調(diào)ERBB3的表達(dá)（P<0.01）。圖5-1：荷A549裸鼠移植瘤蛋白表達(dá)水平圖5-2：荷H1975裸鼠移植瘤蛋白灰度比注：1.H組為南方紅豆杉水提物組，G組為吉非替尼組，H+G組為吉非替尼聯(lián)合南方紅豆杉水提物組，D組為對照組。表5：南方紅豆杉水提物聯(lián)合吉非替尼對荷H1975裸鼠移植瘤蛋白表達(dá)影響指標(biāo)組別HGH+GDβ-actine1.0001.0001.0001.000MET0.260±0.013**▲1.057±0.028**1.411±0.019**▲1.176±0.174▲p-MET0.497±0.015**▲1.333±0.014**0.592±0.009**▲1.493±0.036▲ERBB31.835±0.022**▲1.006±0.014**0.638±0.009▲0.612±0.010▲p-ERBB30.494±0.013**▲1.430±0.007**0.492±0.003**▲1.224±0.010▲注：1.H組為南方紅豆杉水提物組，G組為吉非替尼組，H+G組為吉非替尼聯(lián)合南方紅豆杉水提物組，D組為對照組。2.與對照組比較，*表示0.01<P<0.05，**表示P<0.01；與吉非替尼組單藥組比較，△表示0.01<P<0.05，▲表示P<0.01。（三）南方紅豆杉水提物聯(lián)合吉非替尼對荷PC9、PC9/R、A549、H1975裸鼠移植瘤HGF/MET通路相關(guān)mRNA表達(dá)的影響1.南方紅豆杉水提物聯(lián)合吉非替尼對荷PC9裸鼠移植瘤HGF/MET通路相關(guān)mRNA表達(dá)的影響由下圖、下表可見，在荷PC9裸鼠移植瘤中，南方紅豆杉水提物單藥灌胃組的MET、ERBB3mRNARQ值均顯著低于對照組（P<0.01）。圖6：荷PC移植瘤mRNA表達(dá)RQ值注：1.H組為南方紅豆杉水提物組，D組為對照組。表6：南方紅豆杉水提物聯(lián)合吉非替尼對荷PC9裸鼠移植瘤mRNARQ值表達(dá)影響指標(biāo)組別HDMET0.482±0.087**1.000ERBB30.253±0.038**1.000注：1.H組為南方紅豆杉水提物組，D組為對照組。2.與對照組比較，*表示0.01<P<0.05，**表示P<0.01。2.南方紅豆杉水提物聯(lián)合吉非替尼對荷PC9/R裸鼠移植瘤HGF/MET通路相關(guān)mRNA表達(dá)的影響由下圖、下表可見，在荷PC9/R裸鼠移植瘤中，吉非替尼單藥灌胃組較對照組能夠下調(diào)METmRNA的表達(dá)（P<0.05），ERBB3mRNA較對照組無顯著性差異。較吉非替尼組，南方紅豆杉水提物聯(lián)合吉非替尼能下調(diào)MET的表達(dá)（P<0.05），顯著下調(diào)ERBB3的表達(dá)（P<0.01）。南方紅豆杉水提物單藥灌胃組的MET、ERBB3mRNARQ值均在統(tǒng)計學(xué)意義上顯著低于對照組（P<0.01）。圖7：荷PC9/R裸鼠移植瘤mRNA表達(dá)RQ值注：1.H組為南方紅豆杉水提物組，G組為吉非替尼組，H+G組為吉非替尼聯(lián)合南方紅豆杉水提物組，D組為對照組。表7：南方紅豆杉水提物聯(lián)合吉非替尼對荷PC9/R裸鼠移植瘤mRNA表達(dá)影響指標(biāo)組別HGH+GDMET0.474±0.083**▲0.800±0.126*0.640±0.130**△1.000△ERBB30.683±0.040*▲1.059±0.2230.416±0.130**▲1.000注：1.H組為南方紅豆杉水提物組，G組為吉非替尼組，H+G組為吉非替尼聯(lián)合南方紅豆杉水提物組，D組為對照組。2.與對照組比較，*表示0.01<P<0.05，**表示P<0.01；與吉非替尼組單藥組比較，△表示0.01<P<0.05，▲表示P<0.01。3.南方紅豆杉水提物聯(lián)合吉非替尼對荷A549裸鼠移植瘤HGF/MET通路相關(guān)mRNA表達(dá)的影響由下圖、下表可見，在荷A549裸鼠移植瘤中，吉非替尼單藥組較對照組能夠顯著上調(diào)MET、ERBB3mRNA的表達(dá)（P<0.01）。較吉非替尼組，南方紅豆杉水提物聯(lián)合吉非替尼能顯著下調(diào)MET的表達(dá)（P<0.01），上調(diào)ERBB3的表達(dá)。而南方紅豆杉水提物單藥能夠顯著上調(diào)MET、ERBB3mRNA的表達(dá)（P<0.01）。圖8：荷A549裸鼠移植瘤mRNA表達(dá)RQ值注：1.H組為南方紅豆杉水提物組，G組為吉非替尼組，H+G組為吉非替尼聯(lián)合南方紅豆杉水提物組，D組為對照組。表8：南方紅豆杉水提物聯(lián)合吉非替尼對荷A549裸鼠移植瘤mRNA表達(dá)影響指標(biāo)組別HGH+GDMET1.359±0.034**▲1.701±0.065**1.103±0.017*▲1.000▲ERBB31.210±0.007**▲0.731±0.040**1.248±0.017**▲1.000▲注：1.H組為南方紅豆杉水提物組，G組為吉非替尼組，H+G組為吉非替尼聯(lián)合南方紅豆杉水提物組，D組為對照組。2.與對照組比較，*表示0.01<P<0.05，**表示P<0.01；與吉非替尼組單藥組比較，△表示0.01<P<0.05，▲表示P<0.01。4.南方紅豆杉水提物聯(lián)合吉非替尼對荷H1975裸鼠移植瘤HGF/MET通路相關(guān)mRNA表達(dá)的影響由下圖、下表可見，在荷H1975裸鼠移植瘤中，吉非替尼單藥組較對照組能夠顯著上調(diào)ERBB3mRNA的表達(dá)（P<0.01），METmRNA上調(diào)無統(tǒng)計學(xué)意義。較吉非替尼組，南方紅豆杉水提物聯(lián)合吉非替尼能顯著下調(diào)ERBB3的表達(dá)，顯著上調(diào)MET的表達(dá)（P<0.01）。南方紅豆杉水提物單藥灌胃組的MET、ERBB3mRNARQ值均在統(tǒng)計學(xué)意義顯著低于對照組（P<0.01）。圖9：荷H1975裸鼠移植瘤mRNA表達(dá)RQ值注：1.H組為南方紅豆杉水提物組，G組為吉非替尼組，H+G組為吉非替尼聯(lián)合南方紅豆杉水提物組，D組為對照組。表9：南方紅豆杉水提物聯(lián)合吉非替尼對荷H1975裸鼠移植瘤mRNA表達(dá)影響指標(biāo)組別HGH+GDMET0.713±0.050**▲1.221±0.0821.671±0.275**▲1.000ERBB30.564±0.094**▲2.615±0.202**0.947±0.124▲1.000▲注：1.H組為南方紅豆杉水提物組，G組為吉非替尼組，H+G組為吉非替尼聯(lián)合南方紅豆杉水提物組，D組為對照組。2.與對照組比較，*表示0.01<P<0.05，**表示P<0.01；與吉非替尼組單藥組比較，△表示0.01<P<0.05，▲表示P<0.01。三、分析與討論（一）南方紅豆杉的抗腫瘤作用1.中醫(yī)對紅豆杉的認(rèn)識南方紅豆杉是紅豆杉的一種，作為傳統(tǒng)中藥材，紅豆杉在我國歷史上廣為應(yīng)用，但是“紅豆杉”之名在民國時期才出現(xiàn)。紅豆杉古稱“血榧”、“赤杉”、“紅豆樹”等，《欽定授時通考》記載榧“味甘，平澀，無毒，治五痔，去三蟲，輕身明目”，這與《中藥辭海》記載的紅豆杉“驅(qū)蟲”的功效相近[7]。關(guān)于紅豆杉的臨床功效，當(dāng)今《中藥大辭典》等工具書僅有“通經(jīng)利尿”、“治食積，驅(qū)蛔蟲”的作用記載[8,9]。這樣的描述與紅豆杉臨床用于治療消渴、癌病、風(fēng)濕的作用相比過于局限。也說明當(dāng)前對紅豆杉藥性理論等研究和考證尚不完善。關(guān)于紅豆杉的性味、歸經(jīng)與功效，李良松等[10]通過整理史料，提出了紅豆杉味甘、微苦，性平，入肺、胃、大腸經(jīng)，功效為解毒散積、活絡(luò)止痛、利水消腫、化食驅(qū)蟲。主治邪毒內(nèi)蘊(yùn)所致各種疾患，脾胃升降失調(diào)所致的胃脘疼痛、大便秘結(jié)，氣滯血瘀所致食積、納呆，水腫、糖尿病，痔瘡和出血，蛔蟲、絳蟲病及牛皮癬等皮膚病。2.南方紅豆杉抗腫瘤的成分研究（1）南方紅豆杉的主要成分及其抗腫瘤作用南方紅豆杉的主要活性成分為紫杉烷類化合物、黃酮類物質(zhì)、多糖類化合物，以及甾體類、木脂素類、倍半萜類、K、Ca、Zn、Mg、Cu等有機(jī)化合物，無機(jī)元素。南方紅豆杉最廣為人知的抗腫瘤成分即為紫杉醇，它在南方紅豆杉中的含量極少，可以通過與微管蛋白結(jié)合，抑制微管生理性解聚，使腫瘤細(xì)胞細(xì)胞的有絲分裂過程阻滯于G2期，從而達(dá)到抗腫瘤的作用[11]。紫杉醇自1992年在美國上市后，因其廣譜的抗腫瘤作用，當(dāng)前已廣泛應(yīng)用于肺癌、乳腺癌、卵巢癌等惡性腫瘤的化學(xué)治療。也有現(xiàn)代研究表明，紅豆杉多糖亦有抗腫瘤作用，韓飛飛[12]通過動物實(shí)驗研究發(fā)現(xiàn)紅豆杉中多糖對荷S180肉瘤小鼠、荷levis肺癌小鼠和荷HepA肺癌小鼠的腫瘤具有一定的抑制作用，且這種抑制作用與紅豆杉多糖濃度正相關(guān)；此外，紅豆杉多糖還可以提高荷瘤小鼠的耐缺氧能力，荷瘤小鼠游泳耐力，并延長荷瘤小鼠的生命。紅豆杉黃酮亦具有一定的抗腫瘤活性，木犀草素-7-甲醚是一種紅豆杉黃酮物質(zhì)，有研究表明，在IC(50)值為1.291g/mL時，木犀草素-7-甲醚有較強(qiáng)的抗肺癌作用[13]。（2）南方紅豆杉水提物的抗腫瘤作用南方紅豆杉水提物是指以中藥水煎劑方法為指導(dǎo)，通過規(guī)范的方法，用100℃水提取南方紅豆杉溶于水的成分。南方紅豆杉水提物的具體成分尚不明確，可能包括紅豆杉多糖、紅豆杉黃酮等物質(zhì)。紫杉醇是一種紫杉烷類物質(zhì)，在60℃以上，紫杉醇即會迅速降解[14]。因此，在100℃提取的南方紅豆杉水提物理論上不應(yīng)有紫杉醇存在，而南方紅豆杉水提物抗腫瘤的機(jī)制可能與紫杉醇不盡相同。我們的前期研究通過對人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞的研究驗證了這一觀點(diǎn)[6,15,16]，首先，南方紅豆杉通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而非細(xì)胞毒作用達(dá)到抗腫瘤的效果；其次，南方紅豆杉的抗腫瘤效應(yīng)在G0/G1期，而非紫杉醇的G2或M期；第三，在細(xì)胞形態(tài)學(xué)上，南方紅豆杉水提物作用的細(xì)胞形態(tài)以凋亡為主，而紫杉醇作用的細(xì)胞形態(tài)則以壞死為主。針對荷A549細(xì)胞移植瘤裸鼠，我們研究發(fā)現(xiàn)，南方紅豆杉可以顯著下調(diào)Survivin及p-EGFR蛋白的表達(dá)，并能起到抑制移植瘤生長的作用[17]。并通過體內(nèi)外研究進(jìn)一步證實(shí)了南方紅豆杉水提物對A549細(xì)胞及裸鼠移植瘤的作用是通過EGFR/MAPK信號通路實(shí)現(xiàn)的[18]。針對南方紅豆杉水提物的毒性，我們通過動物實(shí)驗得出，相對CTX，南方紅豆杉水提物能夠改善荷A549裸鼠的生存質(zhì)量[19]，而予荷人肺癌A549裸鼠連續(xù)30天予高、中、低劑量的南方紅豆杉水提物灌胃后，其血常規(guī)、生化指標(biāo)均正常且與生理鹽水給藥的對照組相較無顯著性差異。隨著EGFR-TKIs的廣泛應(yīng)用，同時基于南方紅豆杉的臨床療效觀察，南方紅豆杉與EGFR-TKIs的聯(lián)合使用可能具有協(xié)同作用。并通過實(shí)驗證明南方紅豆杉水提物與吉非替尼有協(xié)同作用，可以下調(diào)多種吉非替尼耐藥的NSCLC細(xì)胞株HGF/MET下游的PI3K/AKT、STAT3、ERK通路相關(guān)蛋白和mRNA的表達(dá)。綜上可見，實(shí)驗研究已證明南方紅豆杉水提物具有抑瘤作用，與EGFR-TKIs聯(lián)用有對抗EGFR-TKIs耐藥，且這是通過EGFR下游通路實(shí)現(xiàn)的，而這些下游通路同時也是作為EGFR旁路HGF/MET的下游通路。（二）南方紅豆杉水提物對裸鼠移植瘤HGF/MET信號通路作用的探討1.HGF/MET通路與EGFR-TKI耐藥（1）HGF/MET信號通路的激活可導(dǎo)致EGFR-TKIs耐藥①M(fèi)ET的過表達(dá)、擴(kuò)增與突變MET是一種原癌基因，它最早于1984年在一種骨肉瘤細(xì)胞株中被發(fā)現(xiàn)和提取[20]。其蛋白產(chǎn)物MET的配體是具有酪氨酸激酶活性的肝細(xì)胞生長因子/離散因子（hepaocytegrowthfactor/scatterfactor，HGF/SF）[21]。MET與HGF結(jié)合后，可促使Tyr1349與Tyr1356的磷酸化，并進(jìn)一步激活跨膜的信號傳導(dǎo)[22]。HGF/MET下游的信號信號傳導(dǎo)通路包括ERBB3（HER3）/PI3K/AKT通路，MAPK/ERK通路，STAT通路，NF-ΚB通路，其中又以PI3K/AKT通路最為重要[23-25]。這些通路均已被研究證實(shí)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。對這些下游通路相關(guān)基因、蛋白表達(dá)的研究為腫瘤的發(fā)展，EGFR-TKIs耐藥的研究提供了一些潛在的靶點(diǎn)和分子標(biāo)記。MET與肺癌的發(fā)生密切相關(guān)，其主要機(jī)制包括MET的過表達(dá)，MET的擴(kuò)增與MET的突變。其中最常見的機(jī)制即為MET的過表達(dá)。有研究表明[26]，近60%的肺癌組織中有MET的過表達(dá)，約1-21%的病例有MET的擴(kuò)增，MET的突變發(fā)生率較前兩者低，在非小細(xì)胞肺癌中的出現(xiàn)比例約為5%-10%，可發(fā)生在胞漿區(qū)或胞外區(qū)，但其與HGF/MET通路的激活密切相關(guān)[27,28]。此外，MET可作為一個提示預(yù)后分子標(biāo)志物，其過表達(dá)與擴(kuò)增可導(dǎo)致肺癌患者更差的預(yù)后[29,30]。MET的過表達(dá)或擴(kuò)增與EGFR-TKIs耐藥亦相關(guān)。其機(jī)制可能是繞過被抑制的EGFR磷酸化激酶通路進(jìn)行過表達(dá)或擴(kuò)增，而擴(kuò)增的MET通過旁路激活作用啟動下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，逃避EGFR-TKIs的殺傷作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，進(jìn)而導(dǎo)致EGFR-TKIs的耐藥。約5%–22%出現(xiàn)EGRF-TKIs獲得性耐藥的NSCLC患者有MET基因的擴(kuò)增[31-34]。有臨床研究表明，在接受厄洛替尼或吉非替尼治療后耐藥的肺腺癌患者中，有21%出現(xiàn)了MET擴(kuò)增，相較于未接受藥物治療的患者（3%出現(xiàn)MET擴(kuò)增）有明顯增加，說明了MET與獲得性耐藥相關(guān)[31]。體外實(shí)驗亦證實(shí)，HCC827細(xì)胞系予遞增濃度的吉非替尼后，可出現(xiàn)MET7q31.1至7q33.3區(qū)域的擴(kuò)增[32]。②HGF的過表達(dá)HGF是一種多功能細(xì)胞因子，主要來自間質(zhì)細(xì)胞，以旁分泌方式作用于鄰近細(xì)胞，作為配體與細(xì)胞表面的受體即MET蛋白結(jié)合，激活酪氨酸激酶，具有較強(qiáng)的促有絲分裂，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞遷移、侵襲以及誘導(dǎo)血管生成等作用。HGF的過表達(dá)在EGFR-TKIs耐藥過程中亦起到了重要作用，有實(shí)驗研究表明，HGF誘導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞株可誘導(dǎo)MET的磷酸化，繞過EGFR，激活ERBB3(HER3)/PI3K/Akt和MAPK-ERK1/2等下游通路，促進(jìn)組織細(xì)胞的活化增殖，導(dǎo)致EGFR-TKIs耐藥[35]。由此我們可以推斷，HGF的過表達(dá)，引起的MET磷酸化使腫瘤細(xì)胞不僅對厄洛替尼、吉非替尼等可逆性EGFR-TKI產(chǎn)生耐藥，還會對不可逆EGFR-TKIs如阿法替尼產(chǎn)生耐藥。最新也有研究認(rèn)為HGF通過穩(wěn)定某些腫瘤相關(guān)蛋白的活性進(jìn)而引起EGFR-TKIs的臨床耐藥，這些蛋白包括酪氨酸激酶受體AXL、E-phA2以及CUB結(jié)構(gòu)域包含蛋白1(CDCP1)等[36]。③ERBB3ERBB3(HER3)與ERBB1（HER1）、ERBB2(HER2)、ERBB4(HER4)共同構(gòu)成了表皮生長因子家族，它具有酪氨酸激酶活性，由ERBB基因編碼。近20年來，ERBBs與配體結(jié)合啟動下游信號通路介導(dǎo)細(xì)胞的增殖，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到的作用已得到了共識。相較ERBB1、ERBB2透徹的研究，關(guān)于ERBB3的研究相對較少。原因之一是ERBB3胞內(nèi)區(qū)缺乏能夠被檢測到的較強(qiáng)的酪氨酸激酶活化信號，其二是在腫瘤組織中較少發(fā)現(xiàn)ERBB3的突變[37]。但是近年來，ERBB3被發(fā)現(xiàn)與EGFR-TKIs的耐藥相關(guān)。有研究表明，在MET擴(kuò)增的EGFR耐藥細(xì)胞株中，MET可能通過對ERBB3的轉(zhuǎn)磷酸作用使其可以繞過被EGFR-TKIs阻滯活性的EGFR，從而激活下游通路[31]。EGFR-TKIs對EGFR的阻滯作用亦有可能導(dǎo)致ERBB3活性“代償性”的增加[38]。④HGF/MET通路的激活與ERBB3由上文可見，MET的過表達(dá)或擴(kuò)增在ERBB3介導(dǎo)EGFR-TKIs耐藥密切相關(guān)。而MET的過表達(dá)、擴(kuò)增或突變與HGF/MET信號通路的激活互為因果。因此，ERBB3是與HGF/MET信號通路激活密切相關(guān)的一種分子。有研究表明，ERBB3依賴的PI3K/AKT信號通路的激活是介導(dǎo)吉非替尼耐藥的重要機(jī)制[39]。下圖闡明了HGF/MET信號通路如何通過ERBB3介導(dǎo)了EGFR-TKI耐藥。由圖中可見，在EGFR被吉非替尼阻滯后，吉非替尼敏感細(xì)胞ERBB3下游的PI3K/AKT通路不能被激活，而在MET擴(kuò)增的吉非替尼耐藥細(xì)胞中，MET能夠作用于ERBB3的胞內(nèi)區(qū)域使PI3K/AKT信號通路激活，從而實(shí)現(xiàn)了EGFR-TKIs耐藥。因此，同時研究ERBB3與HGF/MET通路具有重要意義。圖10：HGF/MET信號通路與ERBB3介導(dǎo)吉非替尼耐藥2.抗HGF/MET通路克服EGFR-TKI耐藥的基礎(chǔ)與臨床研究針對HGF/MET通路的激活，當(dāng)前出現(xiàn)了多種靶向藥物，包括單克隆抗體如HGF單抗、MET單抗，非選擇性抑制劑如克里唑替尼等，它們多與EGFR-TKIs聯(lián)合應(yīng)用。針對這些已應(yīng)用于臨床藥物，或正進(jìn)行臨床試驗的藥物，當(dāng)前已有多項研究成果。（1）基礎(chǔ)研究①M(fèi)ET抑制劑：在荷人NSCLC裸鼠移植瘤模型中，MET單抗h224G11能夠顯著抑制小鼠移植瘤的生長，其聯(lián)合長春瑞賓后能夠更顯著的抑制裸鼠移植瘤的生長[40]，另一項研究顯示，厄洛替尼耐藥的裸鼠移植瘤在給予MGCD265（1種小分子MET、VEGFR、Tie-2、RON阻滯劑）聯(lián)合厄洛替尼能體現(xiàn)出顯著的協(xié)同作用，且沒有雙藥疊加的毒性[41]。Onartuzumab（1種MET單抗）聯(lián)合厄洛替尼在荷NCI-H596裸鼠移植瘤上亦體現(xiàn)了顯著的抑瘤作用[42]。②HGF抑制劑：在暴露于煙草致癌物下的HGF過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，采用HGF單抗（L2G7）聯(lián)合吉非替尼治療的小鼠的成瘤率顯著低于L2G7或吉非替尼單藥治療的小鼠[43]。③非選擇性抑制劑：有研究表明，廣譜激酶抑制劑Cabozantinib（XL184，MET，VEGFR-2和RET抑制劑）聯(lián)合吉非替尼能夠抑制吉非替尼耐藥的HCC827GR6細(xì)胞EGFR、ERBB3的磷酸化作用，在荷HCC827GR6裸鼠移植瘤上，Cabozantinib單藥或厄洛替尼單藥均不能達(dá)到雙藥聯(lián)合的腫瘤抑制作用[44]。此外，克里唑替尼聯(lián)合不可逆EGFR-TKI阿法替尼或WZ4002能夠抑制HCC827GR、H1975、PC9/R等細(xì)胞系裸鼠移植瘤的生長[45]。（2）臨床研究①M(fèi)ET抑制劑：在一項納入59位曾接受過治療NSCLC患者的Ⅱ期臨床研究中，Cabozantinib單藥應(yīng)用能達(dá)到PR人數(shù)5人，SD人數(shù)27人，PD人數(shù)10人，12周的疾病控制率為42%[46]。Onartuzumab在一項Ⅱ期臨床研究中被更深一步的研究，該項研究共納入了128位曾經(jīng)治療過的EGFR未突變的NSCLC患者，治療組為Onartuzumab聯(lián)合厄洛替尼，對照組為厄洛替尼聯(lián)合安慰劑，結(jié)果顯示，兩組間PFS（HR，1.1；95%CI,0.7–1.6）值與OS（HR，0.8；95%CI，0.5–1.3）值無顯著性差異。在亞組分析中可見，厄洛替尼聯(lián)合Onartuzumab較厄洛替尼聯(lián)合安慰劑在MET擴(kuò)增的患者取得了較好的療效[47,48]。②HGF抑制劑：在一項納入15位亞洲裔的，多數(shù)曾接受過EGFR-TKI治療（10人）的NSCLC（不可切除）患者的Ⅰb期臨床研究中，HGF單抗Ficlatuzumab聯(lián)合吉非替尼在最佳劑量下獲得了如下臨床結(jié)果，PR人數(shù)5人，SD人數(shù)4人，PD人數(shù)3人，中位治療時間為12周（范圍：3.6-40周）?；谝陨辖Y(jié)果，F(xiàn)iclatuzumab將針對亞洲裔人群進(jìn)行Ⅱ期的臨床研究[49]。綜上可見，盡管HGF/MET通路在基礎(chǔ)和臨床都有了一定數(shù)量的研究，特別是基礎(chǔ)研究得出了METMab等HGF/MET通路抑制劑聯(lián)合EGFR-TKIs對細(xì)胞和實(shí)驗動物取得了一定的療效，但是目前尚缺乏決定性的研究成果表明當(dāng)前的HGF/MET抑制劑對延長患者的PFS、OS有顯著性作用。此外，由于參與臨床試驗的藥物在國內(nèi)多未上市，上市的克里唑替尼價格昂貴，因此，研究中藥HGF/MET通路抑制劑十分必要。3.南方紅豆杉水提物抑制荷人NSCLC細(xì)胞株裸鼠移植瘤HGF/MET通路抗吉非替尼耐藥（1）南方紅豆杉水提物抑制荷人PC9裸鼠移植瘤HGF/MET通路的作用在荷PC9裸鼠移植瘤的mRNA表達(dá)上，南方紅豆杉水提物單藥的MET、ERBB3mRNARQ值均顯著低于對照組（P<0.01）。南方紅豆杉水提物單藥組較對照組能夠顯著下調(diào)p-MET、ERBB3、p-ERBB3蛋白的表達(dá)（P<0.01），上調(diào)MET蛋白的表達(dá)（P<0.01）?？梢姡戏郊t豆杉水提物單藥能夠在mRNA水平抑制荷PC9裸鼠移植瘤MET、ERBB3mRNA的表達(dá)，并能抑制p-MET、ERBB3、p-ERBB3蛋白的表達(dá)以達(dá)到抑制HGF/MET通路的作用。（2）南方紅豆杉水提物抑制荷人PC9/R裸鼠移植瘤HGF/MET通路的作用在荷PC9/R裸鼠移植瘤的mRNA表達(dá)上，吉非替尼單藥組較對照組能夠下調(diào)METmRNA的表達(dá)（P<0.05），ERBB3mRNA較對照組無顯著性差異。較吉非替尼組，南方紅豆杉水提物聯(lián)合吉非替尼能下調(diào)MET的表達(dá)（P<0.05），顯著下調(diào)ERBB3的表達(dá)（P<0.01）。南方紅豆杉水提物單藥組的MET、ERBB3mRNARQ值均在統(tǒng)計學(xué)意義上顯著低于對照組（P<0.01）。在蛋白表達(dá)上，吉非替尼單藥組能夠顯著上調(diào)荷PC9/R裸鼠移植瘤MET、p-MET的表達(dá)（P<0.01），下調(diào)ERBB3的表達(dá)（P<0.05），顯著下調(diào)p-ERBB3的表達(dá)（P<0.01）。相較于吉非替尼組，南方紅豆杉水提物聯(lián)合吉非替尼組能夠顯著下調(diào)荷PC9/R裸鼠移植瘤MET、p-MET、ERBB3、p-ERBB3的表達(dá)（P<0.01）。南方紅豆杉水提物單藥組較對照組亦能夠顯著下調(diào)MET、p-MET、ERBB3、p-ERBB3的表達(dá)（P<0.01）。由此可見，對荷PC9/R裸鼠移植瘤，吉非替尼單藥不能在mRNA水平上抑制MET、ERBB3mRNA的表達(dá)，但能在蛋白表達(dá)水平上上調(diào)MET、p-MET的表達(dá)，這一作用可能是通過MET蛋白的過表達(dá)或MET配體HGF過表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。南方紅豆杉水提物聯(lián)合吉非替尼組能下調(diào)MET、ERBB3mRNA，以及MET、p-MET、ERBB3、p-ERBB3蛋白的表達(dá)，說明南方紅豆杉水提物聯(lián)合吉非替尼可能在mRNA水平上抑制MET、ERBB3mRNA的表達(dá)，并體現(xiàn)在了蛋白的低表達(dá)中。南方紅豆杉水提物單藥能在mRNA水平上抑制MET、ERBB3mRNA的表達(dá)，并體現(xiàn)于蛋白的表達(dá)中，說明南方紅豆杉水提物能夠通過抑制MET、ERBB3mRNA的表達(dá)抑制HGF/MET通路的激活，實(shí)現(xiàn)對抗EGFR-TKIs耐藥及抗腫瘤作用。（3）南方紅豆杉水提物抑制荷人A549裸鼠移植瘤HGF/MET通路的作用在荷A549裸鼠移植瘤的mRNA表達(dá)上，吉非替尼單藥組較對照組能夠顯著上調(diào)MET、ERBB3mRNA的表達(dá)（P<0.01）。較吉非替尼組，南方紅豆杉水提物聯(lián)合吉非替尼能顯著下調(diào)MET的表達(dá)（P<0.01），上調(diào)ERBB3的表達(dá)。而南方紅豆杉水提物單藥能夠顯著上調(diào)MET、ERBB3mRNA的表達(dá)（P<0.01）。在蛋白表達(dá)上，吉非替尼單藥組能夠顯著上調(diào)MET、p-MET、ERBB3、p-ERBB3的表達(dá)（P<0.01）。相較于吉非替尼組，南方紅豆杉水提物聯(lián)合吉非替尼組能夠顯著下調(diào)荷A549裸鼠移植瘤MET、p-MET、ERBB3、p-ERBB3的表達(dá)（P<0.01）。南方紅豆杉水提物單藥組較對照組能夠顯著下調(diào)ERBB3的表達(dá)（P<0.01），能上調(diào)MET、p-MET、p-ERBB3的表達(dá)（P<0.01）。由上可見，對A549裸鼠移植瘤，吉非替尼單藥能夠在mRNA水平上上調(diào)MET、ERBB3mRNA的表達(dá)，MET、p-MET、ERBB3、p-ERBB3的高表達(dá)亦證實(shí)了這一點(diǎn)，說明吉非替尼可能通過實(shí)現(xiàn)了MET、ERBB3基因水平上的擴(kuò)增。南方紅豆杉水提物聯(lián)合吉非替尼僅能在mRNA水平下調(diào)METmRNA，卻能在蛋白水平上下調(diào)MET、p-MET、ERBB3、p-ERBB3的表達(dá)，這說明雙藥聯(lián)合能通過抑制HGF/MET通路激活對抗吉非替尼的耐藥，其機(jī)制可能是抑制MET擴(kuò)增、MET、ERBB3蛋白的過表達(dá)。南方紅豆杉單藥不能在mRNA水平上實(shí)現(xiàn)對MET、ERBB3的調(diào)控，也不能實(shí)現(xiàn)對發(fā)揮作用的p-MET、p-ERBB3蛋白的下調(diào)作用。說明南方紅豆杉水提物單藥對抑制荷A549裸鼠移植瘤HGF/MET通路激活無明顯作用。（4）南方紅豆杉水提物抑制荷人H1975裸鼠移植瘤HGF/MET通路的作用在荷H1975裸鼠移植瘤的mRNA表達(dá)上，吉非替尼單藥組較對照組能夠顯著上調(diào)ERBB3mRNA的表達(dá)（P<0.01），METmRNA上調(diào)無統(tǒng)計學(xué)意義。較吉非替尼組，南方紅豆杉水提物聯(lián)合吉非替尼能顯著下調(diào)ERBB3mRNA的表達(dá)，顯著上調(diào)METmRNA的表達(dá)（P<0.01）。南方紅豆杉水提物單藥組的MET、ERBB3mRNARQ值均在統(tǒng)計學(xué)意義顯著低于對照組（P<0.01）。在蛋白表達(dá)上，吉非替尼單藥組能夠顯著上調(diào)ERBB3、p-ERBB3的表達(dá)（P<0.01），下調(diào)MET，p-MET的表達(dá)（P<0.01）。相較于吉非替尼組，南方紅豆杉水提物聯(lián)合吉非替尼組能夠顯著下調(diào)荷H1975裸鼠移植瘤p-MET、ERBB3、p-ERBB3的表達(dá)（P<0.01），上調(diào)MET的表達(dá)（P<0.01）。南方紅豆杉水提物單藥組較對照組亦能夠顯著下調(diào)MET、p-MET、p-ERBB3的表達(dá)（P<0.01），上調(diào)ERBB3的表達(dá)（P<0.01）。綜上可見，吉非替尼單藥對荷H1975裸鼠移植瘤有上調(diào)ERBB3mRNA及其蛋白表達(dá)的作用，對MET的基因和蛋白表達(dá)均無上調(diào)作用。因此吉非替尼對HGF/MET通路無明確激活作用。南方紅豆杉水提物聯(lián)合吉非替尼能夠下調(diào)ERBB3mRNA的表達(dá)，上調(diào)METmRNA的表達(dá)，并下調(diào)荷H1975裸鼠移植瘤p-MET、ERBB3、p-ERBB3的表達(dá)，上調(diào)MET的表達(dá)。H1975作為T790M突變細(xì)胞株，其裸鼠移植瘤獲得性耐藥機(jī)制是EGFR的二次突變，南方紅豆杉水提物聯(lián)合吉非替尼雖能對抗吉非替尼耐藥，其機(jī)制可能不是主要通過抑制HGF/MET通路的激活，而是通過抑制EGFR及其下游信號通路的活化。而南方紅豆杉單藥能夠通過下調(diào)MET、ERBB3mRNA，p-MET、ERBB3、p-ERBB3蛋白的表達(dá)實(shí)現(xiàn)抑制HGF/MET通路的激活，達(dá)到抗腫瘤作用。（三）工作展望HGF/MET信號通路的激活在EGFR-TKIs耐藥中的作用是近年來非小細(xì)胞肺癌研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)之一，因為它的激活與EGFR-TKIs的應(yīng)用密切相關(guān)。我們的前期研究已表明南方紅豆杉水提物能通過抑制EGFR下游的ERK、STAT3、PI3K/AKT信號通路克服吉非替尼耐藥，而這些信號通路同樣是HGF/MET通路下游的通路。本實(shí)驗通過研究南方紅豆杉水提物對荷PC9、PC9/R、A549、H1975細(xì)胞株裸鼠移植瘤的作用，得到了南方紅豆杉水提物能抑制HGF/MET通路的結(jié)論。但是，這一結(jié)論尚待進(jìn)一步的實(shí)驗研究驗證，下一步課題組將采用血清藥理學(xué)的方法，用含藥動物血清培養(yǎng)NSCLC細(xì)胞系進(jìn)一步研究HGF/MET通路的作用。我們亦將完善本次實(shí)驗缺乏陽性對照組的缺憾，采用MET抑制劑作為陽性對照，同時采用不可逆性EGFR-TKI抑制劑作為受試藥物之一，用不可逆EGFR-TKIs排除南方紅豆杉水提物對EGFR二次突變的影響，更直觀、更科學(xué)地通過體內(nèi)外實(shí)驗明確南方紅豆杉水提物對HGF/MET通路的作用。同時，針對南方紅豆杉水提物成分尚不明確這一問題，課題組將對其進(jìn)行成分研究，希望能篩選出有效成分，使南方紅豆杉水提物的有效成分更好地應(yīng)用于臨床。總之，南方紅豆杉水提物尚待進(jìn)一步的研究，以闡明其對抗EGFR-TKIs耐藥乃至其抗腫瘤的機(jī)制。四、小結(jié)（一）成功建立了荷PC9、PC9/R、A549、H1975裸鼠移植瘤模型。（二）吉非替尼單藥能通過激活HGF/MET通路上調(diào)荷PC9/R、A549裸鼠移植瘤p-MET等蛋白表達(dá)。（三）較吉非替尼組，南方紅豆杉水提物聯(lián)合吉非替尼組能通過抑制HGF/MET通路下調(diào)荷PC9/R、A549裸鼠移植瘤METmRNA、MET、p-MET、ERBB3、p-ERBB3蛋白的表達(dá)。（四）南方紅豆杉水提物單藥能抑制荷PC9、PC9/R、H1975裸鼠HGF/MET通路上MET、ERBB3mRNA，p-MET、p-ERBB3蛋白的表達(dá)。結(jié)論第一，南方紅豆杉水提物聯(lián)合吉非替尼能通過抑制HGF/MET通路達(dá)到對抗荷PC9/R、A549裸鼠移植瘤吉非替尼耐藥的作用。第二，南方紅豆杉水提物單藥通過能抑制荷PC9、PC9/R、H1975裸鼠HGF/MET通路達(dá)到抗腫瘤的作用。參考文獻(xiàn)[1]MaPC,JagadeeswaranR,JagadeeshSetal.Functionalexpressionandmutationsofc-MetanditstherapeuticinhibitionwithSU11274andsmallinterferingRNAinnon-smallcelllungcancer.CancerRes2005;65:1479–1488.[2]Surveillance,Epidemiology,andEndResults.Table1.1.EstimatedNewCancerCasesandDeathsfor2010.AllRaces,BySex.Availableathttp://seer./csr/1975_2007/results_single/sect_01_table.01.pdf,accessedSeptember4,2012.[3]MolinaJR,YangP,CassiviSD,SchildSE,AdjeiAA.Non-smallcelllungcancer:epidemiology,riskfactors,treatment,andsurvivorship.MayoClinProc,2008,83(5):584-594.[4]SiegelR,MaJ,ZouZ,JemalA.Cancerstatistics,2014.CACancerJClin.2014Jan-Feb;64(1):9-29.[5]XuL,KikuchiE,XuC,EbiH,ErcanDetal.CombinedEGFR/METorEGFR/HSP90inhibitioniseffectiveinthetreatmentoflungcancerscodrivenbymutantEGFRcontainingT790MandMET.CancerRes.2012,72:3302-3311.[6]徐穎扉,張晶,舒琦瑾.南方紅豆杉水提物誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡與紫杉醇抑瘤機(jī)制不同的研究.中華中醫(yī)藥雜志.2012,6(27):1696-1699.[7]鄂爾泰,張廷玉．欽定授時通考.文淵閣四庫全書．第732冊,臺北:臺灣商務(wù)印書館股份有限公司,1986:1．[8]江蘇新醫(yī)學(xué)院．中藥大辭典．上海:上?？萍汲霭嫔?1995:926．[9]國家中醫(yī)藥管理局．中華本草．第4卷．上海:上?？萍汲霭嫔?2004:343．[10]李良松,馮仲科,劉德慶.紅豆杉名實(shí)與功用通考.中國中藥雜志.2011,36(12):1682-1685.[11]阮煜,霍鋒,張純,等.紅豆杉屬植物的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展.陜西林業(yè)科學(xué),2006,(2):1-5.[12]韓飛飛.紅豆杉多糖純化、結(jié)構(gòu)分析和抗腫瘤活性研究.杭州:浙江大學(xué),2006.[13]SaewanN,KoysomboonS,ChantraprommaK.Anti-tyrosinaseandanti-canc