香蕉枯萎病木霉的體外拮抗作用研究

香蕉枯萎病木霉的體外拮抗作用研究

香蕉是嶺南四大優(yōu)良水果之一，在廣東、海南、廣東等地種植面積較大。近年來，香蕉枯萎（富有生物科學(xué)）相繼發(fā)生在廣東省、廣東省、廣東省和其他土地上。這種疾病具有很強(qiáng)的抗旱性，可以長期生活在土壤中。香蕉枯萎病是典型的土傳病害,侵染來源主要是帶菌的吸芽、病株殘體及帶菌土壤,病菌從寄主根部傷口侵入寄主,通過寄主維管束向假莖上部及葉部蔓延,使香蕉生產(chǎn)受到了極大的威脅,香蕉產(chǎn)業(yè)面臨被摧毀的危險。目前防治枯萎病的主要方法是培育抗病品種、使用化學(xué)藥劑和利用農(nóng)業(yè)措施等,但還沒有一種理想的防治香蕉枯萎病的化學(xué)藥劑,研制藥效持久、且對人體和生態(tài)環(huán)境無害的生防菌劑成為我國乃至全世界的發(fā)展方向。拮抗性木霉是一種很好的生防微生物,廣泛分布于土壤、空氣、枯枝落葉及各種發(fā)酵物上且極易分離和培養(yǎng),據(jù)報道木霉能對18個屬中29種植物病原真菌有拮抗效果,木霉作為一種具有重要開發(fā)價值的自然資源正逐漸被農(nóng)業(yè)生物防治領(lǐng)域研究、開發(fā)和利用。已報道用于防治致病性尖孢鐮刀菌引起枯萎病的主要有哈茨木霉(T.harzianum)、綠色木霉(T.viride)和擬康氏木霉(T.pseudokoningii)等。筆者對拮抗香蕉枯萎病鐮刀菌的木霉菌株進(jìn)行分離篩選,以期為香蕉枯萎病的防治提供基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1試驗中的菌株和材料1.1.2培養(yǎng)基和實(shí)驗設(shè)備改良的馬丁氏-孟加拉紅培養(yǎng)基、PDA、電子天平、pH酸度計、振蕩器、搖床、三角瓶、涂玻棒、無菌操作臺、酒精燈等。1.2方法分別在海南儋州、霸王嶺、尖峰嶺、廣東湛江等地采集土樣進(jìn)行分離,4次采集共152份土樣(表1)。根據(jù)采樣地點(diǎn)、采集基質(zhì)類別進(jìn)行編號。1.2.2微生物數(shù)量的測定(1)土壤懸浮液制備:稱取土壤稀釋成懸浮液至10-2、10-3、10-4;(2)木霉選擇培養(yǎng)基配置:即改良的馬丁氏-孟加拉紅培養(yǎng)基;(3)平板涂布:將土壤稀釋懸浮液在振蕩器上振蕩10~20s,吸取100μL溶液至平板中央,用涂布棒涂勻,并做好濃度標(biāo)記,涂好的平板正放靜置5min,使溶液滲透進(jìn)平板中,重復(fù)3次,將涂好的平板用黑色塑料袋包好倒置于28℃人工氣候箱中培養(yǎng)3~5d;(4)結(jié)果計算:每克土樣中微生物的數(shù)量=同一稀釋度的3個平板上菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)/含菌樣品克數(shù)。純化的木霉菌在平板上培養(yǎng),用打孔器打取菌碟,置于平板上,恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)定期觀察菌落生長情況,菌株篩選以菌落均勻一致、菌絲豐富且產(chǎn)孢量大為指標(biāo)。1.2.3木霉和尖孢鐮菌生長距離的測定(1)菌株篩選:用大板,木霉生長速度比較快,很快占優(yōu)勢,所以這個步驟要病原菌的孢子濃度高達(dá)108而木霉的孢子濃度106即可;(2)對峙培養(yǎng):將大板篩出的理想菌株與病原菌做對峙培養(yǎng),即將木霉和尖孢鐮刀菌點(diǎn)接在平板兩邊緣,相距5~6cm,倒置放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),重復(fù)3次,以僅接種尖孢鐮刀菌菌株為對照,定期觀察木霉對其抑制作用,并記錄菌落生長半徑及相互作用情況,同時做木霉和尖孢鐮刀菌的純培養(yǎng)試驗并記錄菌落滿皿時間。測試項目及記載標(biāo)準(zhǔn)如下:接種后168h測量尖孢鐮刀菌菌株的直線生長距離dB和dCK,木霉菌株的直線生長距離dT按以下公式計算抑菌率:抑菌率/%=(dCK-dB)/dCK×100(dCK:對照組接種尖孢鐮刀菌后168h的直線生長距離;dB:對峙培養(yǎng)組接種枯萎病菌后168h的直線生長距離;dT:木霉接種平板后168h的直線生長距離);(3)對峙培養(yǎng)72h后,挑取兩菌落交界面菌絲制片,用顯微鏡觀察木霉與病原菌交集處菌絲生長情況并跟蹤觀察。1.2.4抗菌作用測定木霉代謝產(chǎn)物分為揮發(fā)性與難揮發(fā)性物質(zhì),木霉菌的抗生作用就測這兩類代謝產(chǎn)物對病原菌的拮抗作用。(1)難揮發(fā)代謝產(chǎn)物抑菌作用的測定用圓盤濾膜法測定:在PDA平板上,平鋪上直徑略大于9cm的雙層玻璃紙(硝酸纖維素膜),在平板中央接種已活化3d的供試木霉菌塊(d=5mm),每個處理重復(fù)3次,28℃培養(yǎng),待供試木霉菌落直徑達(dá)5cm后去玻璃紙,再在平板中央接種直徑為5mm尖孢鐮刀菌,28℃培養(yǎng)5d。以不含供試木霉菌株代謝產(chǎn)物的PDA平板接種尖孢鐮刀菌為對照。接種后第2天開始觀察,分別用十字法測定菌落的生長半徑,計算抑制率,考察抗生作用。(2)易揮發(fā)代謝產(chǎn)物抑菌作用采用對扣法測定,將活化3d的供試木霉菌株菌絲塊,接種于PDA平板中央,28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待菌落直徑達(dá)5cm時,取出菌塊,在其上蓋上雙層直徑略大于10cm的無菌濾膜,上方扣一個相等大小、中央剛接種尖孢鐮刀菌菌絲塊的平板。用透明膠帶密封后,以未接供試木霉菌株的PDA平板與接種尖孢鐮刀菌平板對扣培養(yǎng)作為對照,在28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),每處理重復(fù)3次,連續(xù)培養(yǎng)5d,測定對尖孢鐮刀菌生長的抑制作用,考察易揮發(fā)代謝產(chǎn)物抑菌作用。1.2.5香蕉枯渙病菌株foc4-2木霉選用對峙培養(yǎng)實(shí)驗中拮抗效果達(dá)81.30%且可以寄生病原菌的T-C2菌株,病原菌用本實(shí)驗室分離保存的香蕉枯萎病菌株FOC4-B2。測定無菌土中木霉拮抗病原菌種群動態(tài)變化方法:用一次性水杯,內(nèi)裝無菌土50g/杯,在無菌土中添加木霉與FOC4-B2分別至108cfu/g,每周用平板涂布法測無菌土中菌落數(shù)量(跟蹤觀察6周),以此計算孢子數(shù)量,并繪制出6周內(nèi)木霉和病原菌數(shù)量的動態(tài)變化圖。2結(jié)果與分析2.1特征以及顯微鏡下的蓮子形態(tài)從4次采集的152份土樣中,分離到330個木霉菌株,部分木霉菌落純培養(yǎng)特征以及顯微鏡下的孢子形態(tài)見表2。用木霉選擇性培養(yǎng)基復(fù)篩后得到拮抗效果較好的10個木霉菌株,編號為:T-B1、T-C1、T-C2、T-H3、T-H6、T-H8、T-H11、T-H12、T-R2、T-Wl1(表1)。2.2木霉菌株對尖孢鐮菌的抑菌效果根據(jù)對峙培養(yǎng)實(shí)驗結(jié)果,在330個木霉菌株中,初篩出147株對尖孢鐮刀菌株有抑菌作用,占總株數(shù)的44.5%;其中10株抑菌力相對較強(qiáng)的木霉菌株對尖孢鐮刀菌的抑菌率大于50%,占總株數(shù)的3.0%(表3);有55.5%的木霉菌株對尖孢鐮刀菌的抑菌率在50%以下。T-C2、T-B1、T-H6、T-H8、T-Wl1菌株的重寄生能力很強(qiáng)。在木霉與尖孢鐮刀菌接觸處,病原菌絲變枯黃,顯微鏡下可以看到菌絲被纏繞、折斷,木霉菌絲也停止生長,木霉的孢子可以在病原菌菌落上生長。2.3各病原菌抑菌效果通過對峙培養(yǎng)實(shí)驗選出的10株優(yōu)良菌株,采用圓盤濾膜法測定其難揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對尖孢鐮刀菌的抑制作用。結(jié)果表明(表4),培養(yǎng)120h后,對病原菌的抑菌效果達(dá)到50%以上的有8株。其中T-C2效果最好,達(dá)到88.08%,病原菌菌絲不能在平板上擴(kuò)展;其它的木霉菌株對病原菌有不同程度的抑制作用,主要表現(xiàn)為菌絲生長受阻。采用對扣法測定木霉揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對尖孢鐮刀菌的抑制作用結(jié)果表明,木霉菌株揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對病原菌有一定的抑制作用,但是所有木霉菌株的抑菌率均低于50%,明顯低于難揮發(fā)代謝產(chǎn)物的抑菌率。2.4土壤中的木霉病和寄生蟲的動態(tài)變化從圖1可見,在實(shí)驗第1周,孢子數(shù)量已經(jīng)降了3個數(shù)量級,第2周木霉孢子數(shù)量達(dá)到最低,后又較快增長,而病原菌則是呈一直下降的趨勢。3木霉與尖孢鐮菌的生長香蕉枯萎病是香蕉栽培生產(chǎn)上的毀滅性真菌土傳病害,目前還沒有一種理想的防治香蕉枯萎病的化學(xué)藥劑,也沒有優(yōu)良性狀的抗病品種,因此,以生物防治為主導(dǎo)的綜合防治措施的研究,對致病性尖孢鐮刀菌防治具有非常重要的意義,而容易分離的木霉對枯萎病原菌具有顯著的防治效果。在對峙培養(yǎng)試驗中,在兩菌落的交接處形成對峙界面,挑取界面處的菌絲做涂片,在光學(xué)顯微鏡下觀察兩種菌絲的交接情況,可以看到木霉對枯萎病菌絲有纏繞、穿透的現(xiàn)象,同時木霉在生長過程中還能產(chǎn)生抗生素和胞外酶,使病菌菌絲的細(xì)胞質(zhì)消解、菌絲斷裂、溶解、消失。木霉防治主要是通過競爭、拮抗作用、重寄生、胞外酶降解、產(chǎn)生抗生素等一系列拮抗作用有效抑制許多病原菌的活動。目前以對哈茨木霉的研究最為深入,電鏡掃描表明,哈茨木霉對枯萎病菌菌絲有強(qiáng)烈的寄生作用,產(chǎn)生吸器直接穿入枯萎病菌菌絲,分泌胞外溶菌酶,從而減輕病害。在對峙培養(yǎng)72h后,大部分的木霉菌和尖孢鐮刀菌的菌絲已經(jīng)接觸,各木霉菌株的直線生長距離不等,與之對應(yīng)的尖孢鐮刀菌菌絲直線生長距離也不等。因此測定培養(yǎng)72h后兩菌的直線生長距離dT和dB,在一定程度上反映了各木霉菌株對養(yǎng)料和空間的競爭能力,以及對尖孢鐮刀菌產(chǎn)生的不同程度的拮抗,同時接種72h后,尖孢鐮刀菌停止生長,部分可寄生木霉菌株在其菌落表面上開始生長,生長較快的菌株在接種后168h已經(jīng)越過對方接種點(diǎn)長到培養(yǎng)皿邊緣,因此培養(yǎng)168h后的尖孢鐮刀菌菌株生長直線距離dB為木霉菌幾種機(jī)制綜合作用的結(jié)果,可作為直接的篩選指標(biāo)。本實(shí)驗中篩選的木霉菌株有一部分對尖孢鐮刀菌有重寄生作用,其中T-C2菌效果較好,以其做無菌土中木霉與病原菌的動態(tài)變化實(shí)驗,結(jié)果表明木霉在土壤中對病原菌有抑制作用,在測定時兩個菌落的孢子濃度都顯著下降,這與菌株在土壤中的定植能力有關(guān)。木霉生長比較快,搶先占用了營養(yǎng)和空間,使得