基質(zhì)中酶的提取及活力測定方法研究進(jìn)展

基質(zhì)中酶的提取及活力測定方法研究進(jìn)展

在木聚糖酶的生產(chǎn)、銷售和應(yīng)用等流通鏈中，酶活力是質(zhì)量控制的重要指標(biāo)，其測定方法是確定結(jié)果是否正確的關(guān)鍵。根據(jù)木聚糖酶的來源及應(yīng)用,所存在的基質(zhì)包括微生物發(fā)酵液、飼料、食品添加劑、紙漿等。基質(zhì)中酶活力受多種因素影響,如溫度、pH、激活劑、抑制劑等。另外,為提高酶制劑的穩(wěn)定性,無活性載體常被用來將酶進(jìn)行吸附固定,在檢測時(shí)如何將酶提取出來也較為關(guān)鍵。其測定方法可按原理不同分為粘度法、瓊脂糖擴(kuò)散法、生色底物法、酶聯(lián)吸附分析法和目前使用較多的還原糖法等。1兩種酶的提取酶的提取質(zhì)量受提取溶劑、溫度、提取時(shí)間的影響。同一種酶在不同的基質(zhì)環(huán)境中抽提條件也不同。Cosson等在測飼料中木聚糖酶活力時(shí)用pH4.8的檸檬酸鈉-磷酸鹽緩沖液在室溫下攪拌提取0.5h,離心取上清作為酶提取液。高玲等研究浙江酶、華芬酶、Avizyme-1500三種酶制劑中木聚糖酶的提取,發(fā)現(xiàn)華芬酶、Avizyme-150中最佳抽提條件為0.1mol/L的氯化鈉溶液4℃抽提12h,而浙江酶是蒸餾水4℃提取12h。蘇玉春等采用雙水相法從黑曲霉的發(fā)酵液中提取木聚糖酶,即選用PEG4000提取體系,其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為19%,磷酸氫二鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%,氯化鈉濃度為0,親水性聚合物水溶液在一定條件下形成雙水相后,酶在兩相中分配不同,來達(dá)到提純目的。2酶提取物的生命力由氨基酸中的酶提取決定2.1底物粘度的測定該法是通過測木聚糖酶對底物粘度的降解率來衡量酶的活性高低,以阿拉伯木聚糖,水溶性木聚糖衍生物等作為底物。底物粘度可通過測流量的粘度計(jì)以及振動(dòng)旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)等現(xiàn)代電子設(shè)備,引起的電阻變化被轉(zhuǎn)化為酶活力單位。雖然粘度法比較靈敏,但操作復(fù)雜繁瑣,重復(fù)性差,不能測定底物的米氏常數(shù),不常使用。2.2木聚糖酶活力測定該法的理論基礎(chǔ)是剛果紅與多糖的顯色反應(yīng)。將木聚糖和瓊脂混合制成凝膠板,在瓊脂板上切開一條鑿,將酶溶液倒入到鑿內(nèi)與底物在適當(dāng)條件下發(fā)生酶水解,水解一段時(shí)間后通過直接測定水解區(qū)域的直徑來反映酶活力的大小。飼料本身還原糖不與剛果紅發(fā)生反應(yīng),因此有報(bào)道將其運(yùn)用于飼料中木聚糖酶的活力測定。該法操作簡單,雖不受飼料本身還原糖的干擾,但培養(yǎng)時(shí)間長,對透明圈的分析較為復(fù)雜,準(zhǔn)確性低于其他非擴(kuò)散法。2.3水解反應(yīng)對木聚糖酶活力的影響該法是將生物素基-木聚糖底物包被在酶標(biāo)板上,加入木聚糖酶在一定溫度條件下酶解后,洗掉已降解的木聚糖,用堿性磷酸酶抗生蛋白鏈菌素偶聯(lián)于酶標(biāo)板上未被降解的生物素基-木聚糖上,然后,加入堿性磷酸酶的底物(對硝基苯磷酸酯)進(jìn)行顯色反應(yīng),根據(jù)顯色的深淺來定量未被降解的木聚糖的量,由此間接地測定木聚糖酶的活力。該法操作簡單,成本低,不會因底物中含有過多還原糖而影響測定結(jié)果,但是如何針對該方法提取樣品(消化道食糜和飼料)中的酶以及如何消除樣品中的內(nèi)源底物的干擾等仍有待于解決。2.4合成芳基類物該法是對底物進(jìn)行化學(xué)修飾后使其帶有特定的熒光物質(zhì)或染料,在木聚糖酶催化下釋放染料或熒光物質(zhì),通過釋放于乙醇中的染料或熒光物質(zhì)的多少來反映酶活的大小?？捎玫娜玖嫌欣遵R氏亮藍(lán)(RetnazolbrilliantBlueR,RBB)、剛果紅等,熒光材料有2-(2-苯丙噻唑)酚(2-(2-benzothiazolyl)-phenyl)、4-甲基傘形酮(4-methylumbelliferyl)、熒光增白劑(Calcofluor)等。目前文獻(xiàn)報(bào)道合成一種較好的熒光底物6,8-difluoro-4-methyl-umbelliferylβ-D-xylobioside(DiFMUX2),找到了內(nèi)切-β-1,4-木聚糖酶的最佳染色底物為芳基4-硫-β-木糖甘。該類方法操作簡單,但由于底物制備的特殊性,提高了測定成本,且該法對溫度、離子強(qiáng)度、乙醇濃度及影響染色片段溶解度的因素非常敏感。另外,飼料酶作用的底物是酶的天然底物,不宜采用該法測活力。2.5還原糖法該法是利用木聚糖經(jīng)酶促水解產(chǎn)生的還原端基被氧化所產(chǎn)生產(chǎn)物的量來計(jì)算酶活力,包括DNS法、MBTH法等。2.5.1比色法測定還原糖和反應(yīng)液的顏色強(qiáng)度法該法是利用3,5-二硝基水楊酸(DNS)在堿性條件下與木聚糖酶解產(chǎn)物的還原末端反應(yīng)生成橙黃-棕紅色的氨基化合物,在一定范圍內(nèi),還原糖的量和反應(yīng)液的顏色強(qiáng)度呈比例關(guān)系,利用比色法測定還原糖的量來表示酶活力。該法是目前最常采用的方法之一,所得產(chǎn)物顏色穩(wěn)定性好,操作簡單,蛋白質(zhì)對測定無干擾,且測定精密度高。但該法的靈敏度較低,特別是對于Km值較大的酶活力測定情況很難測得酶解初速度,從而不能準(zhǔn)確的檢測酶含量極低的飼料等基質(zhì)中的酶活力。2.5.2還原活性的測定該法同DNS法都屬于還原糖法,原理是3-甲基-2-苯并噻唑酮腙MBTH)首先與酶解液中的還原端基反應(yīng)生成嗪,過量的MBTH被Fe3+氧化成陽離子,再與嗪反應(yīng)生成青藍(lán)色化合物,在一定范圍內(nèi),還原端基的量和反應(yīng)液的顏色強(qiáng)度呈正比,測定波長為630nm或650nm。MBTH法常應(yīng)用于微量甲醛含量的測定。由于該法靈敏度較高,在木聚糖酶解程度極低的條件下即可測得酶活力,而水解產(chǎn)物中大分子糖鏈的還原端基不會因分子量的略微變化而有大的反應(yīng)性改變,即,不同聚合度的同類還原糖,其還原端的顯色吸光系數(shù)基本相同,因此,所得活力測定數(shù)值不會象DNS法那樣偏離測定真值。該法已被應(yīng)用于幾丁質(zhì)酶、溶菌酶的活力測定,其靈敏度比DNS法高十倍以上。3多糖水解酶活力盡管某些還原糖法在化學(xué)計(jì)量方面也存在問題,但由于操作簡便且重復(fù)性好,因此被廣泛用于基質(zhì)中多糖水解酶的活力測定。而其測定手段又較為多樣化,包括試管體系及微孔板法。3.1活性物質(zhì)的提取又稱終點(diǎn)法,酶解反應(yīng)在試管中進(jìn)行。酶與底物于試管中混合后于恒溫水浴鍋中進(jìn)行酶催化反應(yīng),反應(yīng)結(jié)束后用終止液終止酶解過程。氧化劑與還原產(chǎn)物進(jìn)行顯色反應(yīng)后,用分光光度法測定吸光度值。該法適合于在一定時(shí)間內(nèi)酶解速率不變的活力測定,但不能進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析。3.2微量進(jìn)樣器法該法主要是用96孔板在恒溫振蕩器中進(jìn)行酶解反應(yīng),用酶標(biāo)儀測定并完成數(shù)據(jù)的高通量分析。操作過程中最好使用8道式或12道式微量進(jìn)樣器。該法操作簡單方便、迅速,試劑用量少,一次可處理大量樣品以實(shí)現(xiàn)高通量分析,從而降低測定成本,提高測定效率。如Grishutin等將BCA法采用微孔板體系,進(jìn)行了底物專一性研究。但由于該法對微孔板品質(zhì)、恒溫振蕩器的溫度均勻性要求較高,因此,其精密度、準(zhǔn)確度稍遜于試管法。4其他可能用于測定木聚糖酶活性的方法可能其他方法4.1還原端基的量該法是利用酶解產(chǎn)物中還原端基在發(fā)生氧化還原反應(yīng)過程中釋放的電子與還原端基的量呈比例關(guān)系的特點(diǎn)來測得還原端基的量從而得到酶活力的。如在鐵氰化鉀安培法中,酶解產(chǎn)生的還原端基在堿性條件下把Fe(CN)63-還原成電化學(xué)氧化還原活性物Fe(CN)64-,它能被電極上的正電位氧化為Fe(CN)63-,并釋放一個(gè)電子,因此可根據(jù)Fe(CN)64-氧化電流信號計(jì)算還原糖的含量。4.2速率成比例的關(guān)系該法適用于Km值較小時(shí)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)測定。其原理是根據(jù)酶催化反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的熱量與底物降解速率成比例的關(guān)系進(jìn)行酶活力測定的。多糖降解時(shí)所產(chǎn)生的熱量太小,在活力測定時(shí)可加入多糖氧化酶和過氧化氫酶來放大反應(yīng)焓信號。此法靈敏度高于還原糖法,但由于酶催化水解產(chǎn)生較少的還原端基,而造成后續(xù)的多糖氧化酶表現(xiàn)較低活性,因此不能準(zhǔn)確測定表觀摩爾焓變值。5活力測定方法的選擇酶是生物活性蛋白質(zhì),基質(zhì)中酶的活力測定還受提取劑、提取溫度及提取時(shí)間的影響,基質(zhì)本身也具有能溶于緩沖液的大量雜性物質(zhì),也會對酶活力造成一定損失,使測定結(jié)果不準(zhǔn)確。由于還原糖法操作簡單、快捷、便于定量,因此迄今為止仍是木聚糖酶最為常用的活力測定方法,其測定手段多樣,可根據(jù)測定需要選擇不同方法。其中,DNS法在國家標(biāo)準(zhǔn)中使用最多,但靈敏度較低,所測活力值往往偏高。MBTH法的靈敏度較高,因而可測得酶解初速度,受蛋