腦脊液細(xì)胞學(xué)邁-格-姬染色在隱球菌腦膜炎診斷中的應(yīng)用

腦脊液細(xì)胞學(xué)邁-格-姬染色在隱球菌腦膜炎診斷中的應(yīng)用

新隱性桿菌的長期病史、臨床表現(xiàn)、腦脊液常規(guī)檢查和圖像檢查缺乏特異性，臨床診斷困難，預(yù)后差。即使是正規(guī)治療，死亡率也達(dá)到20%-30%。因此為臨床提供早期的診斷依據(jù)是減少漏診、誤診,改善預(yù)后的關(guān)鍵。目前確診主要依靠腦脊液中病原體檢測(cè)。本文作者整理了近四年來我院確診的隱球菌腦膜炎48例,分析腦脊液細(xì)胞學(xué)MGG染色在其診斷中的價(jià)值。1數(shù)據(jù)和方法1.1局灶腦功能缺損者本組48例,男29例,女19例,年齡4~83歲,平均43.9±20.3歲,病程4~365d,全部病例均有頭痛,21例伴有發(fā)熱,1例病程中有抽搐發(fā)作。體檢腦膜刺激征陽性者4例。有局灶腦神經(jīng)功能缺損者2例,1例為一側(cè)外展神經(jīng)麻痹,1例同時(shí)損害視力和聽力,1例為肢體無力,2例患者均有意識(shí)障礙。所有病例均為我院住院或門診病人,經(jīng)腦脊液細(xì)胞學(xué)MGG染色、涂片墨汁染色和阿利新蘭染色檢查發(fā)現(xiàn)新型隱球菌而確診,其中尚合并隱球菌肺炎1例,合并乙型病毒性肝炎(HB)1例,合并丙型病毒性肝炎1例,合并獲得性免疫缺陷病毒感染(HIV)1例,合并2型糖尿病1例,合并系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)2例,合并結(jié)締組織病2例,同時(shí)合并HIV、HB的1例,合并甲狀腺功能亢進(jìn)癥1例,合并帶狀皰疹1例,未合并其它免疫功能異常疾患者32例。1.2隱球形正常染色有發(fā)熱、頭痛等典型臨床表現(xiàn);腦脊液普通墨汁染色、細(xì)胞學(xué)MGG染色及阿利新蘭染色中任意一種檢查檢出隱球菌確診隱球菌腦膜炎,抗真菌治療有效者納入。1.3方法1.3.1高倍鏡觀察和高倍鏡觀察取腦脊液3~5ml置于普通試管中,以2000r/min,離心10min后棄去上清液,將沉淀物置于潔凈玻片上,用印度墨汁混合后加蓋玻片置于低倍鏡下,先從邊緣開始搜索,可適當(dāng)調(diào)整顯微鏡的可變光欄,如發(fā)現(xiàn)在黑色背景中有帶著暈輪的圓形透光且如細(xì)胞大小的物質(zhì),即轉(zhuǎn)用高倍鏡仔細(xì)觀察其結(jié)構(gòu),若見菌體周圍有寬大透明的莢膜,即為隱球菌。可以在黑色背景上見到透亮的圓形隱球菌,尤如夜晚天空中閃爍的星星,見圖1。1.3.2mgg染色取腦脊液0.5ml,采用粟式FMU-6玻片離心沉淀法收集細(xì)胞,細(xì)胞學(xué)MGG染色,在高倍鏡下檢測(cè),光鏡下可直接觀察到隱球菌,呈大小不等、相隔距離基本相同的紫藍(lán)色圓形茁體,有的可見圓形小芽孢從茁體長出,中心折光性較強(qiáng),有的周圍可見半弧形莢膜。多數(shù)呈簇排列,也有散在單個(gè)存在,見圖2。1.4統(tǒng)計(jì)處理所得數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)取a=0.05,P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1傳統(tǒng)骨髓細(xì)胞學(xué)分類首次腰穿44例病人腰穿時(shí)腦脊液壓力均不同程度升高,其中6例腰穿時(shí)腦脊液測(cè)壓大于300mmH2O。腦脊液外觀無色透明。白細(xì)胞計(jì)數(shù)均有不同程度的增高。各病例首次腦脊液病理學(xué)檢查結(jié)果:細(xì)胞學(xué)分類均呈混合細(xì)胞反應(yīng),淋巴細(xì)胞、激活型淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及激活型單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞各占一定比例,有時(shí)可見漿細(xì)胞及吞噬細(xì)胞,偶見嗜酸性粒細(xì)胞。其中30例呈淋巴細(xì)胞為主的混合細(xì)胞反應(yīng),小淋巴細(xì)胞加激活型淋巴細(xì)胞所占比例大于50%,最高達(dá)95.5%;5例呈嗜中性粒細(xì)胞為主的混合反應(yīng),嗜中性粒細(xì)胞所占比例大于50%,最高達(dá)81%;其余13例呈混合型,但單個(gè)核細(xì)胞均多于多個(gè)核細(xì)胞。2.2mgg染色檢測(cè)48例患者中,墨汁染色檢出33例,靈敏度為68.8%(95%可信區(qū)間為67.92%~69.68%);MGG染色檢出46例,靈敏度為95.8%(95%可信區(qū)間為95.64%~95.97%)。數(shù)據(jù)表明,MGG染色診斷隱腦的靈敏度高于墨汁染色,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3smt檢測(cè)方法反滲透膜檢查的應(yīng)用新型隱球菌性腦膜炎(cryptococcusmeningitis,CM)是一種嚴(yán)重危害人類健康的深部真菌病。新型隱球菌的主要致病因子有莢膜和酚氧化酶。由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)封閉性高,機(jī)體免疫不易起作用;且代謝旺盛,葡萄糖含量低,可刺激酚氧化酶活性,同時(shí)有大量?jī)翰璺影房勺鳛榉友趸牡孜?因此,新型隱球菌對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有高親和性。隱球菌性腦膜炎臨床表現(xiàn)多變,腦脊液常規(guī)檢查和頭顱影像學(xué)檢查缺乏特異性,容易漏診或誤診為結(jié)核性腦膜炎。目前,腦脊液涂片墨汁染色查見或培養(yǎng)分離出隱球菌是隱球菌性腦膜炎診斷金標(biāo)準(zhǔn),且墨汁染色操作簡(jiǎn)單迅速,隱球菌和背景差別較大,易于觀察,特異性高,適合在基層醫(yī)院推廣。但由于隱球菌性腦膜炎腦脊液內(nèi)菌量差異較大檢出率低,文獻(xiàn)報(bào)道新型隱球菌性腦膜炎腦脊液隱球菌檢出率第1次為66%,第2次17.8%,其余需要3~20次涂片才能發(fā)現(xiàn)陽性。由于隱球菌性腦膜炎腦脊液細(xì)胞學(xué)和生化檢查缺乏特異性,而單次墨汁染色陽性率太低,因此發(fā)展新型快速的隱球菌檢測(cè)方法對(duì)提高隱球菌性腦膜炎診斷效率極為重要。近年來,有多種血清學(xué)、免疫學(xué)以及PCR方法被用來診斷隱球菌性腦膜炎,但這些方法均費(fèi)時(shí)費(fèi)力,花費(fèi)較高,不適合基層使用;且這些方法雖然敏感度較高,但是由于無法直接對(duì)隱球菌進(jìn)行觀察,因此無法排除假陽性的情況。腦脊液細(xì)胞學(xué)MGG染色是細(xì)胞學(xué)檢查的常規(guī)手段,是一種簡(jiǎn)單易行的病理檢查方法,MGG染色的隱球菌在光鏡下有其獨(dú)特的形態(tài)學(xué)特點(diǎn),隱球菌呈團(tuán)簇狀分布,且能觀察到典型的莢膜和毛刺結(jié)構(gòu),具有和腦脊液內(nèi)免疫細(xì)胞迥然不同的結(jié)構(gòu),因此易于觀察和分辨。本組病例中46例MGG首次染色即為陽性,陽性率為95.8%,說明此項(xiàng)檢查是防止誤診的有效手段。對(duì)于初期及治療后期隱腦患者,腦脊液中隱球菌數(shù)量少,且多數(shù)隱球菌莢膜缺陷,墨汁染色不能檢出,玻片離心沉淀法MGG染色卻可以使極少量的隱球菌得到富集,極大提高了檢出水平,對(duì)患者的早期治療及維持期用藥提供實(shí)驗(yàn)室證據(jù)。此外細(xì)胞學(xué)檢查除檢出隱球菌外,還可以看到單核吞噬細(xì)胞吞噬隱球菌,這對(duì)了解藥物療效起著重要參考作用。且標(biāo)本存放時(shí)間較長,便于長期觀察及治療前后進(jìn)行對(duì)照。由此可見,腦脊液細(xì)胞學(xué)MGG染色檢查采用玻片離心沉淀法收集標(biāo)本檢出隱球菌較傳統(tǒng)的墨汁染色法采用試管離心法收集標(biāo)本隱球菌陽性檢出率更高,更直接,而且在細(xì)胞學(xué)檢查時(shí)一步完成,無需特殊染色,是一種首選的快捷便利的方法,因此,對(duì)疑似新型隱球菌腦膜炎的病例除常規(guī)進(jìn)行腦脊液涂片墨汁染色外,應(yīng)將腦脊液MGG染色細(xì)胞學(xué)檢查列為常規(guī)檢查。由于MGG染色對(duì)檢驗(yàn)人員的技術(shù)水平要求較高,當(dāng)隱球菌散在出現(xiàn)時(shí)易與腦脊液中的小淋巴細(xì)胞相混淆,早期會(huì)忽視,本組病例中就發(fā)現(xiàn)1例MGG染色陰性而墨汁染色陽性,因此,對(duì)疑似標(biāo)本可在MGG染色的基礎(chǔ)上再行印度墨汁染色予以確認(rèn)。由于隱球菌莢膜內(nèi)含有大量的酸性粘多糖,可被阿利新蘭染液著色,所以阿利新蘭染色對(duì)于隱球菌是特染,染色對(duì)比清晰,同時(shí)對(duì)其它炎性細(xì)胞不表達(dá),特異性高。本組資料中有1例患者墨汁染色陰性,MGG染色陰性而經(jīng)過阿利新