腦脊液細胞學邁-格-姬染色在隱球菌腦膜炎診斷中的應(yīng)用

腦脊液細胞學邁-格-姬染色在隱球菌腦膜炎診斷中的應(yīng)用

新隱性桿菌的長期病史、臨床表現(xiàn)、腦脊液常規(guī)檢查和圖像檢查缺乏特異性，臨床診斷困難，預(yù)后差。即使是正規(guī)治療，死亡率也達到20%-30%。因此為臨床提供早期的診斷依據(jù)是減少漏診、誤診,改善預(yù)后的關(guān)鍵。目前確診主要依靠腦脊液中病原體檢測。本文作者整理了近四年來我院確診的隱球菌腦膜炎48例,分析腦脊液細胞學MGG染色在其診斷中的價值。1數(shù)據(jù)和方法1.1局灶腦功能缺損者本組48例,男29例,女19例,年齡4~83歲,平均43.9±20.3歲,病程4~365d,全部病例均有頭痛,21例伴有發(fā)熱,1例病程中有抽搐發(fā)作。體檢腦膜刺激征陽性者4例。有局灶腦神經(jīng)功能缺損者2例,1例為一側(cè)外展神經(jīng)麻痹,1例同時損害視力和聽力,1例為肢體無力,2例患者均有意識障礙。所有病例均為我院住院或門診病人,經(jīng)腦脊液細胞學MGG染色、涂片墨汁染色和阿利新蘭染色檢查發(fā)現(xiàn)新型隱球菌而確診,其中尚合并隱球菌肺炎1例,合并乙型病毒性肝炎(HB)1例,合并丙型病毒性肝炎1例,合并獲得性免疫缺陷病毒感染(HIV)1例,合并2型糖尿病1例,合并系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)2例,合并結(jié)締組織病2例,同時合并HIV、HB的1例,合并甲狀腺功能亢進癥1例,合并帶狀皰疹1例,未合并其它免疫功能異常疾患者32例。1.2隱球形正常染色有發(fā)熱、頭痛等典型臨床表現(xiàn);腦脊液普通墨汁染色、細胞學MGG染色及阿利新蘭染色中任意一種檢查檢出隱球菌確診隱球菌腦膜炎,抗真菌治療有效者納入。1.3方法1.3.1高倍鏡觀察和高倍鏡觀察取腦脊液3~5ml置于普通試管中,以2000r/min,離心10min后棄去上清液,將沉淀物置于潔凈玻片上,用印度墨汁混合后加蓋玻片置于低倍鏡下,先從邊緣開始搜索,可適當調(diào)整顯微鏡的可變光欄,如發(fā)現(xiàn)在黑色背景中有帶著暈輪的圓形透光且如細胞大小的物質(zhì),即轉(zhuǎn)用高倍鏡仔細觀察其結(jié)構(gòu),若見菌體周圍有寬大透明的莢膜,即為隱球菌?？梢栽诤谏尘吧弦姷酵噶恋膱A形隱球菌,尤如夜晚天空中閃爍的星星,見圖1。1.3.2mgg染色取腦脊液0.5ml,采用粟式FMU-6玻片離心沉淀法收集細胞,細胞學MGG染色,在高倍鏡下檢測,光鏡下可直接觀察到隱球菌,呈大小不等、相隔距離基本相同的紫藍色圓形茁體,有的可見圓形小芽孢從茁體長出,中心折光性較強,有的周圍可見半弧形莢膜。多數(shù)呈簇排列,也有散在單個存在,見圖2。1.4統(tǒng)計處理所得數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計學處理,計數(shù)資料采用卡方檢驗,檢驗水準取a=0.05,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。2結(jié)果2.1傳統(tǒng)骨髓細胞學分類首次腰穿44例病人腰穿時腦脊液壓力均不同程度升高,其中6例腰穿時腦脊液測壓大于300mmH2O。腦脊液外觀無色透明。白細胞計數(shù)均有不同程度的增高。各病例首次腦脊液病理學檢查結(jié)果:細胞學分類均呈混合細胞反應(yīng),淋巴細胞、激活型淋巴細胞、單核細胞及激活型單核細胞、嗜中性粒細胞各占一定比例,有時可見漿細胞及吞噬細胞,偶見嗜酸性粒細胞。其中30例呈淋巴細胞為主的混合細胞反應(yīng),小淋巴細胞加激活型淋巴細胞所占比例大于50%,最高達95.5%;5例呈嗜中性粒細胞為主的混合反應(yīng),嗜中性粒細胞所占比例大于50%,最高達81%;其余13例呈混合型,但單個核細胞均多于多個核細胞。2.2mgg染色檢測48例患者中,墨汁染色檢出33例,靈敏度為68.8%(95%可信區(qū)間為67.92%~69.68%);MGG染色檢出46例,靈敏度為95.8%(95%可信區(qū)間為95.64%~95.97%)。數(shù)據(jù)表明,MGG染色診斷隱腦的靈敏度高于墨汁染色,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。3smt檢測方法反滲透膜檢查的應(yīng)用新型隱球菌性腦膜炎(cryptococcusmeningitis,CM)是一種嚴重危害人類健康的深部真菌病。新型隱球菌的主要致病因子有莢膜和酚氧化酶。由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)封閉性高,機體免疫不易起作用;且代謝旺盛,葡萄糖含量低,可刺激酚氧化酶活性,同時有大量兒茶酚胺可作為酚氧化的底物,因此,新型隱球菌對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有高親和性。隱球菌性腦膜炎臨床表現(xiàn)多變,腦脊液常規(guī)檢查和頭顱影像學檢查缺乏特異性,容易漏診或誤診為結(jié)核性腦膜炎。目前,腦脊液涂片墨汁染色查見或培養(yǎng)分離出隱球菌是隱球菌性腦膜炎診斷金標準,且墨汁染色操作簡單迅速,隱球菌和背景差別較大,易于觀察,特異性高,適合在基層醫(yī)院推廣。但由于隱球菌性腦膜炎腦脊液內(nèi)菌量差異較大檢出率低,文獻報道新型隱球菌性腦膜炎腦脊液隱球菌檢出率第1次為66%,第2次17.8%,其余需要3~20次涂片才能發(fā)現(xiàn)陽性。由于隱球菌性腦膜炎腦脊液細胞學和生化檢查缺乏特異性,而單次墨汁染色陽性率太低,因此發(fā)展新型快速的隱球菌檢測方法對提高隱球菌性腦膜炎診斷效率極為重要。近年來,有多種血清學、免疫學以及PCR方法被用來診斷隱球菌性腦膜炎,但這些方法均費時費力,花費較高,不適合基層使用;且這些方法雖然敏感度較高,但是由于無法直接對隱球菌進行觀察,因此無法排除假陽性的情況。腦脊液細胞學MGG染色是細胞學檢查的常規(guī)手段,是一種簡單易行的病理檢查方法,MGG染色的隱球菌在光鏡下有其獨特的形態(tài)學特點,隱球菌呈團簇狀分布,且能觀察到典型的莢膜和毛刺結(jié)構(gòu),具有和腦脊液內(nèi)免疫細胞迥然不同的結(jié)構(gòu),因此易于觀察和分辨。本組病例中46例MGG首次染色即為陽性,陽性率為95.8%,說明此項檢查是防止誤診的有效手段。對于初期及治療后期隱腦患者,腦脊液中隱球菌數(shù)量少,且多數(shù)隱球菌莢膜缺陷,墨汁染色不能檢出,玻片離心沉淀法MGG染色卻可以使極少量的隱球菌得到富集,極大提高了檢出水平,對患者的早期治療及維持期用藥提供實驗室證據(jù)。此外細胞學檢查除檢出隱球菌外,還可以看到單核吞噬細胞吞噬隱球菌,這對了解藥物療效起著重要參考作用。且標本存放時間較長,便于長期觀察及治療前后進行對照。由此可見,腦脊液細胞學MGG染色檢查采用玻片離心沉淀法收集標本檢出隱球菌較傳統(tǒng)的墨汁染色法采用試管離心法收集標本隱球菌陽性檢出率更高,更直接,而且在細胞學檢查時一步完成,無需特殊染色,是一種首選的快捷便利的方法,因此,對疑似新型隱球菌腦膜炎的病例除常規(guī)進行腦脊液涂片墨汁染色外,應(yīng)將腦脊液MGG染色細胞學檢查列為常規(guī)檢查。由于MGG染色對檢驗人員的技術(shù)水平要求較高,當隱球菌散在出現(xiàn)時易與腦脊液中的小淋巴細胞相混淆,早期會忽視,本組病例中就發(fā)現(xiàn)1例MGG染色陰性而墨汁染色陽性,因此,對疑似標本可在MGG染色的基礎(chǔ)上再行印度墨汁染色予以確認。由于隱球菌莢膜內(nèi)含有大量的酸性粘多糖,可被阿利新蘭染液著色,所以阿利新蘭染色對于隱球菌是特染,染色對比清晰,同時對其它炎性細胞不表達,特異性高。本組資料中有1例患者墨汁染色陰性,MGG染色陰性而經(jīng)過阿利新