腦源性神經營養(yǎng)因子在細菌性腦膜炎炎癥細胞中的表達

腦源性神經營養(yǎng)因子在細菌性腦膜炎炎癥細胞中的表達

腦源性神經營養(yǎng)因子（nbu）在中樞神經系統(tǒng)的發(fā)育過程中起著重要作用，包括調節(jié)神經的生存、生殖、成熟和再生。它也是維持神經系統(tǒng)存活和正常生理功能的必要因素，以促進神經損傷后的再生。BDNF的最適配體為TrkB受體,BDNF與TrkB受體結合并激活酪氨酸激酶,從而激發(fā)細胞內各種信號轉導,發(fā)揮生物學效應。BDNF對免疫的調節(jié)作用日益受到關注,在炎癥損傷情況下,僅偶有報道散發(fā)性腦白質病變和多發(fā)性硬化患者腦組織內滲出的炎癥細胞有高表達的BDNF,然而BDNF和TrkB在細菌性腦膜炎滲出的炎癥細胞中的表達尚不清楚。本研究通過建立3周齡大鼠細菌性腦膜炎模型,探討B(tài)DNF和受體TrkB在幼年大鼠細菌性腦膜炎炎癥細胞中的表達,這對于深入研究BDNF在急性細菌性腦膜炎時的免疫作用有著十分重要的意義。1材料和方法1.1cif/l肺炎鏈球菌Ⅲ型菌株(31003-16)購自北京中國藥品生物制品鑒定所,接種于血瓊脂糖培養(yǎng)液,在37℃5%CO2環(huán)境中生長過夜,再移種于VITALAER肉湯里,生長至對數(shù)生長中期收菌,用生理鹽水沖洗2次,再稀釋成1010cfu/L。1.2肺炎球形細菌感染大鼠wbc后分離培養(yǎng)取自浙江大學醫(yī)學實驗動物中心3周齡SD大鼠16只,雌雄不限。隨機分成兩組,感染組10只,對照組6只。用10%水合氯醛0.15~0.3ml/100g體質量靜脈注射麻醉后,固定于立體定位儀。腦膜炎的誘導參照李玲等方法,腦池穿刺,移去50μl腦脊液,感染組注入肺炎鏈球菌菌懸液50μl,對照組注射生理鹽水50μl。置籠中于室溫23℃,明暗各12h,自由飲食。接種后24h,取腦脊液50μl計數(shù)白細胞(WBC)。感染組大鼠感染前腦脊液WBC為(54.06±37.09)×106/L,主要為淋巴細胞,感染后為(4321.24±1230.72)×106/L,主要為中性粒細胞,WBC感染后較感染前明顯升高(F=84.96,P<0.01)。對照組大鼠腦脊液WBC注射前(53.76±32.19)×106/L,注射后(56.01±35.37)×106/L,均以淋巴細胞為主,注射前后無明顯變化(F=0.09,P>0.05)。感染組大鼠感染前腦脊液培養(yǎng)無細菌生長,感染后腦脊液培養(yǎng)出與接種同株的肺炎鏈球菌。對照組大鼠注射前后腦脊液培養(yǎng)均無細菌生長。1.3海馬冠狀面冷凍切片兩組大鼠經主動脈灌流0.1MPBS及4%多聚甲醛,剝離腦組織,再浸入4%多聚甲醛4℃后固定4h,移入30%蔗糖溶液中直至組織塊沉下,速凍,經海馬冠狀面冷凍切片,免疫組化30μm,原位雜交15μm,貼于經賴氨酸預處理的玻片,吹干。1.4晶美生物工程有限公司兔抗大鼠單克隆抗體BDNF(美國Chemicon產品)購自晶美生物工程有限公司。免疫組化二步法染色試劑盒購自福州邁新生物技術開發(fā)公司,二步法染色按試劑盒說明進行。用PBS替代特異性抗-BDNF抗體作為陰性對照。1.5檢測試劑盒BDNF及其受體TrkB地高辛標記的寡核苷酸探針和原位雜交檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司,原位雜交檢測按試劑盒說明進行。用PBS代替探針做雜交陰性反應對照。2結果2.1叛亂分子的出現(xiàn)感染后24h大鼠軟腦膜、蛛網膜下隙及腦室內滲出的炎性細胞可見BDNFmRNA陽性雜交信號(圖1),對照組未見炎性滲出(圖2)。2.2cnf蛋白在炎癥細胞中的發(fā)現(xiàn)感染后24h大鼠軟腦膜、蛛網膜下隙、腦室內滲出的炎性細胞均有較強的陽性染色顆粒(圖3)。對照組未見炎性滲出。2.3trb受體mrna對炎癥細胞的表達感染后24h大鼠軟腦膜、蛛網膜下隙、腦室內滲出的炎性細胞可見TrkBmRNA陽性雜交信號(圖4),對照組未見炎性滲出。3細菌fig和trkb的相互作用BDNF是神經營養(yǎng)因子家族成員之一,對神經元的可塑性、存活以及調節(jié)神經遞質的釋放和樹突的生長發(fā)揮著至關重要的作用。在各種病理損傷狀態(tài)下,BDNF能夠防治神經軸索的損傷,這些作用影響著關鍵神經元的數(shù)量,包括感覺、小腦和脊髓神經元等。BDNF通過結合表達在神經元上的高親和力受體TrkB發(fā)揮其生物學效應,BDNF也通過結合截斷型TrkB受體調節(jié)星形膠質細胞的功能。BDNF主要來自中樞神經系統(tǒng)的神經元,全長型TrkB受體僅表達在神經元上。細菌性腦膜炎時,除神經元表達BDNF蛋白、BDNF和TrkB基因外,蛛網膜下隙、腦室內滲出的炎癥細胞不僅高表達BDNF蛋白、BDNF基因,而且同時表達TrkB基因。這一結果提示,炎癥細胞表達BDNF及BDNF和TrkB基因可能是對細菌侵入的反應,炎癥滲出既可由BDNF介導產生神經保護作用,同時炎癥細胞也是BDNF的靶細胞,在細菌性腦膜炎時,BDNF可能參與調節(jié)免疫反應,進一步證實,BDNF同時作用于神經系統(tǒng)以外的免疫組織。已有的研究認為,在細菌性腦膜炎形成過程中,細菌及其產物進入蛛網膜下隙后,刺激中樞免疫細胞表達細胞因子和炎癥前分子,形成一個復雜的炎癥反應。腫瘤壞死因子(TNF-α)和白介素1(IL-1)作為先驅因子協(xié)同觸發(fā)一系列的炎癥遞質,包括IL-6、IL-8、IL-10、IL-12等細胞因子,化學因子,血小板活化因子,前列腺素,基質金屬蛋白激酶等,這些炎癥遞質在細菌性腦膜炎病理生理的發(fā)展以及腦損傷的形成過程中都發(fā)揮了各自重要的作用,并相互影響,這一炎癥反應決定著細菌性腦膜炎的預后。由此,一直以來采用減輕炎癥反應的治療策略來防治細菌性腦膜炎的神經系統(tǒng)后遺癥,盡管新的強有力的抗生素不斷問世和應用,但近十年來,細菌性腦膜炎神經系統(tǒng)后遺癥的發(fā)生率仍居高不下。我們先前的實驗研究發(fā)現(xiàn),肺炎鏈球菌腦膜炎動物經抗生素治療后BDNF表達明顯降低,皮層、海馬存活神經元明顯減少,補充外源性BDNF輔佐治療后,皮層、海馬存活神經元數(shù)明顯增多。這些研究結果表明,在細菌性腦膜炎時,炎癥細胞表達BDNF,證實炎癥反應和炎癥細胞滲出不僅是有害的,也是有利的,神經營養(yǎng)因子與TNF-α、IL-1β等炎癥遞質可能是細菌性腦膜炎炎癥反應過程中,既有保護又有破壞作用的兩個系統(tǒng),共同影響著病情發(fā)展的勢態(tài)。對于免疫細胞是否表達TrkB受體,國際上還有爭議。有研究報道,在人和鼠淋巴組織和免疫細胞中發(fā)現(xiàn)TrkB受體。一些體外實驗也發(fā)現(xiàn)人B和T細胞中表達TrkBmRNA及其蛋白,但也有研究報道,在體外培養(yǎng)的T細胞和多發(fā)性硬化活檢腦組織里未發(fā)現(xiàn)TrkB的表達。我們的實驗證實,細菌性腦膜炎時,滲出的炎癥細胞不僅表達BDNF基因及其蛋白,還同時表達TrkB受體,提示炎癥細胞也是BDNF的靶器官,BDNF對炎癥細胞的功能究竟有什么樣的作用,BDNF如何通過TrkB介導的細胞內信號傳導調節(jié)免疫功能或免疫反應尚不清楚